1、淺論基因生物起搏研究近況         【摘要】  隨著基因組計劃研究的不斷深入，分子生物學得到了飛速發展，同時也為心臟生物起搏提供了依據和發展空間，現就基因治療在心臟生物起搏中的研究作一綜述。 【關鍵詞】  心臟生物起搏;起搏器;基因生物起搏Abstract: With the development of the Human Genome Project research, molecular biology has been developed enormously, which als

2、o provides the basis and developing opportunities for cardiac biological pacemakers. In this paper, recent researches on genetically biological pacemakers are reviewed.Key words: cardiac biological pacing; pacemakers; gene biological pacing近年來提出的心臟生物起搏是指利用生物學及其相關技術，對機體受損的自律性節律點或傳導障礙的傳導系統進行修復或替代，使機體心

3、臟自身的起搏和傳導功能得以恢復。生物起搏具有神經體液調節反應，并可避免電子起搏器的反復更換、電極脫落、囊帶感染和血腫以及心肌穿孔、心包積液并發癥等缺點，已成為治療緩慢心律失常研究的熱點。生物起搏尚處于起蒙階段，目前的研究主要基于兩方面：(1)細胞生物起搏;(2)基因生物起搏。本文就基因生物起搏的機制和研究近況作以簡述。1 基因生物起搏機制基因生物起搏治療是應用基因工程、細胞生物學技術及心肌生物電產生機制，對受損的自律性細胞或發生傳導障礙的特殊傳導系統的細胞進行基因修復、替換和基因產物的補充或阻斷，即將功能正常的基因轉移到功能異常的細胞中;或用一些專門的基因技術修飾心肌細胞，使心臟中的非起搏細胞

4、具有自律性，成為病人心臟中新的起搏點，替代受損的竇房結或房室結;或是將干細胞移植同時結合轉基因技術，增強起搏電流來發揮起搏點的作用1-3。基因起搏治療主要包括三方面：(1)轉染超極化激活的環核苷酸門控(HCN)基因，形成超極化激活的陽離子流，引起心肌細胞自動去極化，具有起搏功能;(2)轉染kir2.1基因(轉運編碼內向整流電流IK1 1個亞單位)，使得普通心肌細胞轉化為起搏細胞;(3)利用基因工程技術轉染2腎上腺素受體的互補DNA，下調內向整流電流，使自律性心肌細胞高表達起搏電流，形成生物起搏。2 轉染內源性起搏電流基因起搏細胞的電生理特性在于其動作電位結束時能夠自動去極化，即產生舒張期去極化

5、，而產生舒張期去極化的電生理基礎是內源性起搏電流(If)。因此，上調心肌細胞內的If編碼基因的表達即有可能使心肌細胞產生自律性。2.1 HCN編碼基因分型HCN共分為四個亞基，有三個亞基在心臟，即超極化環核苷酸門控陽離子通道1(HCN1)、超極化環核苷酸門控陽離子通道2(HCN2)、超極化環核苷酸門控陽離子通道4(HCN4)。HCN高度表達的心肌細胞可產生If樣起搏電流，能夠觸發心臟搏動。2.2 HCN編碼基因與自律性If由HCN基因家族及Min-K相關肽(MiRP1)共同調控，HCN、MiRP1分別構成通道的、亞單位。其中HCN調節起主要作用，MiRP1起輔助作用，能夠增強If的表達。Lud

6、wig等研究認為HCN2和HCN4通道共同參與If電流的形成，其中HCN2參與If電流快成份的形成，HCN4則參與If電流慢成份的形成。敲除動物HCN基因的研究表明，HCN2亞型的生理功能在于穩定靜息狀態下起搏細胞的舒張期膜電位，從而起穩定起搏節律的作用;而HCN4對產生正常起搏電位和基礎率至關重要，且參與交感神經對心率的調節作用。楊新春等研究也表明在HCN4基因被敲除的小鼠胚胎心臟中記錄不到具有4期自動除極特征的起搏細胞動作電位。2.3 轉染HCN基因2003年Qu等10進行了生物起搏研究，他們將起搏電流基因的亞單位(HCN2)轉染犬左心房，抑制竇房結后心電圖表現出起源于左心房的心律。這種過

7、度表達起搏電流的心肌細胞對細胞內的cAMP有反應，對生理性調節細胞內cAMP的腎上腺素和毒蕈堿拮抗劑也有反應，表明這種生物起搏可以受自體神經激素的調節。Potapova等11應用轉染了心臟起搏基因mHCN2同時表達綠色熒光蛋白的人類間質干細胞(hMSCs)，與大鼠心室肌細胞聯合培養后出現了搏動，且頻率高于對照組,頻率比為(161±4)VS(93±16) bpm(P0.05);注入犬左室壁原位，在竇性停搏時，同樣表現出自發搏動節律頻率實驗組快于對照組,(61±5)VS(45±1) bpm, P0.05)。李繼文等12用含HCN4基因的重組腺病毒AdHCN4

8、感染心肌細胞，結果心肌細胞產生自發搏動頻率，提示HCN4基因有可能成為治療緩慢性心律失常疾病的目的基因。 等13應用細菌內同源重組法構建攜帶人HCN4基因的重組腺病毒載體(Ad-HCN4)，注入到Yorkshire豬左心室游離壁，結果豬左室性心律頻率明顯加快，用無水乙醇消融Ad-HCN4注射區后該心律消失，證實該心律起源于Ad-HCN4注射區。Ad-HCN4轉染心肌細胞可表達較大的If，表明腺病毒介導HCN4通道基因心室局部高表達發揮了生物起搏器的作用，且使用異丙腎上腺素后表現出正性變時性作用，說明生物起搏器具有受自體神經體液因素調節的優點。Huang等14研究竇房結細胞的HCN2和HCN4轉

9、錄水平隨年齡而不同(P0.001)，成年大鼠HCN2的轉錄比幼鼠時下降了近70%(P0.05)，然后保持相對穩定在余下的生命階段(年齡：3.53±0.38;P0.05)HCN4轉錄減少了21%(P0.05)，結果表明，HCN通道可能構成與年齡有關竇房結功能下降的一個重要因素。Plotnikov等15通過制造一個含有N-和C-末端的大鼠HCN2和大鼠跨膜區HCN1嵌合通道(HCN212)并把它植入11只犬的左束支，所有犬在植入(0.9±0.3)天后迅速發展為室性心動過速(VT)心室率120 bpm，最高頻率=(285±37) bpm，并持續到(5±1)天。

10、3 抑制kir2.1基因3.1 kir2.1分子生物學特性Garneau等16研究發現人kir2.1通道蛋白具有拓撲結構，其一級結構包括13個半胱氨酸殘基，7個分布在N端和C端區域，位置分別在43、54、76、89、122、154和311。膜片鉗結果顯示除了C76和C311，其他部位的半胱胺酸單個突變為絲氨酸后，沒有顯著影響單通道的傳導和通道的開放概率。76位的半胱胺酸突變為解離的或不解離極性的氨基酸殘基后，導致通道的活性缺失或者通道的開放概率下降。311位的半胱胺酸突變為絲氨酸或精氨酸或丙氨酸后，引起通道平均關閉時間的增加和出現長的關閉時間，關閉時間間隔500 ms，且通道復活的敏感性降低。

11、這些改變與kir2.1和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)相互作用減弱有關，C311R和C311S的突變比C311A的突變更能明顯的調節kir2.1-PIP2的相互作用17。         3.2 kir2.1基因與自律性kir2.1是心肌細胞中內向整流鉀通道(kir)家族的重要成員之一，其編碼基因為KCNJ2。內向整流鉀電流(IK1)通道是由kir2.1基因家族編碼的只允許內向鉀電流通過，而在竇房結細胞缺乏這種電流。研究表明，成人心室肌細胞也具有起搏的潛能，正常情況下被IK1抵制，這種鉀通道的整流有利于維持

12、心肌細胞的靜息電位和參與動作電位的后期復極過程18。近年來，大量的動物實驗及臨床研究認為，KCNJ2基因mRNA水平在心房顫動患者中明顯增高，且隨心房顫動發作時間的延長增高越明顯19。3.3 抑制kir2.1 基因表達Silva等20發現心室肌細胞的IK1電流抑制達81%后就表現出自發性的動作電位，這時的鈉鈣交換體(INaCa)成為心室肌細胞的起搏電流，而且隨著IK1電流抑制率的增加，心室肌細胞的內在起搏頻率也增加，并且這種心室肌細胞還對受體激動劑有反應。Miake等21應用基因替換技術將編碼IK1的kir2.1基因中的3個氨基酸殘基替換為丙氨酸并將該突變體整合到腺病毒載體上，抑制kir2.1

13、基因表達，然后注入到豚鼠左心室，34 天后，其中80%的IK1電流受到抑制，心臟通過4期自動去極化產生自主節律電活動(室性自主心律) ，同樣發現下調心臟工作細胞的IK1可使其產生起搏電位。李凡東等22-23通過構建抑制大鼠心肌細胞kir2.1基因的短發卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達質粒(pEGFP6-1kir2.1)，轉染到體外培養的大鼠心室肌細胞，結果，轉染48 小時后，實驗組細胞出現自主搏動頻率。因此抑制心室肌細胞的IK1電流制造生物起搏是一種可靠的途徑，但是也帶來早搏增多及復極延長等16負面影響。4 2腎上腺素受體過度表達心臟傳導系統與其他任何部位相比

14、具有豐富的腎上腺素能神經支配，使得竇房結具有豐富的2腎上腺素受體，2腎上腺素受體通過G蛋白耦聯的信號傳遞系統調節心肌的變時、變力作用。交感神經興奮釋放兒茶酚胺類遞質與2腎上腺素受體結合后使cAMP 與HCN通道受體結合，產生較快的膜除極化作用并使心率加快。通過將表達2受體的cDNA導入心肌細胞內，使心肌細胞膜的2受體過度表達，增加自律細胞對內源及外源性腎上腺素的反應以提高心率。Edelberg等24人將編碼2腎上腺素受體基因的質粒注射到豬的心房肌內，48 小時后，出現心房節律，實驗組的心率比對照組快50%。目前對2腎上腺素受體在生物起搏方面的研究并不多，其存在的主要問題(1)通過2腎上腺素受體

15、過度表達提高心率僅能持續34 天，如何獲得長期上調的2腎上腺素受體同時減少由于高表達的2腎上腺素受體而增加的其他疾病風險;(2) 2腎上腺素受體是一種提高心率的非特異性刺激物，其作用不僅僅是作用于起搏電流而且作用于其他的兒茶酚胺敏感性電流，因而2腎上腺素受體過度表達可能是有害的25;(3)作為表達2腎上腺素受體的cDNA腺病毒載體也存在著致病的危險。5 展 望目前基因生物起搏尚處于動物實驗階段，以病毒為載體進行基因治療，本身存在安全質疑。為實現有效、安全的生物起搏，近來有的實驗采取復制-缺陷腺病毒的策略，使病毒DNA保持一種染色體外的狀態，以避免遺傳物質整合到宿主基因組中;還可以采用聯合治療的

16、策略，移植轉基因后的干細胞治療;通過組織工程學技術構建新的竇房結等。心臟生物起搏可以避免人工起搏的諸多缺點，并能適應自主神經調節，隨著研究的深入和技術與方法的不斷完善，基因生物起搏治療將可望成為一種新興的治療緩慢型心律失常的方法。【參考文獻】  1 徐兆龍,劉仁光.心臟生物起搏的研究進展J.國際心血管病雜志,2007,34(2):83 -85. Plotnikov AN, Sosunov EA, Qu J, et al . Biological pacemaker implanted in canine left bundle branch provides ventricular

17、escape rhythms that have physiologically acceptable rates J.Circulation,2004,109(4):506-512. Boink GJ, Seppen J, de Bakker JM, et a1. Gene therapy to create biological pacemakersJ.Med Biol Eng Comput,2007,45(2):167-176. Robinson RB, Brink PR, Cohen IS, et a1. I(f) and the biological pacemakerJ. Phar

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