1、Forpauseonysuy蝿dnofrcachsermuseacre衿suacemhdynpoF膅薂螂罿薆芄基因工程隨堂作業(yè)薁罿羇題目：離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)簡介螂莀聿肄蒄腿院（系）：腿蒅羈專業(yè)：膁艿班級：裊蚃姓名：羀荿學(xué)號：芆肁成績：蠆葿完成日期：蚇袃螂薈襖薅離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)簡介蒁在植物轉(zhuǎn)基因方法中 , 人們總是在全力尋找那些更為簡單、有效而又通用的手段 , 以便繞過復(fù)雜的原生質(zhì)體培養(yǎng)過程 , 實現(xiàn)帶壁細胞的基因轉(zhuǎn)移。于是 , 便開始了應(yīng)用物理方法進行植物轉(zhuǎn)基因的嘗試 , 并獲得了很大進展。其中較為成功的方法有電激法、基因槍或微彈轟擊法、注射法、激光穿孔法和超聲波法。這些方法就其本質(zhì)來說

2、 , 都是使細胞壁穿孔而又不傷害細胞 , 提供外源基因進入受體細胞的通道。薈20世紀 80年代末 , 由于受到離子注入金屬、半導(dǎo)體等材料進行表面改性、摻雜等研究的啟示 , 中國科學(xué)院等離子體物理研究所余增亮等人, 率先嘗試將離子注入技術(shù)應(yīng)用與生物材料 , 進行農(nóng)作物品種的改良, 并于 1986年首次獲得成功。至此, 一個新興的交叉學(xué)科離子束生物工程學(xué)問世 , 并日益受到國內(nèi)外專家的關(guān)注。1991年余增亮等提出了離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移的設(shè)想 , 隨后成功獲得了水稻轉(zhuǎn)基因植株。離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)打破了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因法 ( PEG法、電擊法、脂質(zhì)體法等) 操作繁瑣 , 轉(zhuǎn)化率低 , 重復(fù)性差 , 基

3、因型依賴性強的限制 , 是一種較簡單易行的轉(zhuǎn)基因方法。1.2. 芅 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理羃植物細胞表面存在細胞壁, 是外源基因轉(zhuǎn)移的天然屏障。所有的轉(zhuǎn)基因方法都是通過打破這一屏障 , 或以易于外源基因?qū)氲募毎蚪M織( 如原生質(zhì)體、萌發(fā)胚、子房和幼穗等)作為受體而實現(xiàn)的。離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的原理主要包括了3個方面 , 即通道作用、吸引作用和整合作用。首先 , 一定能量和劑量的離子束對植物細胞壁的濺射作用破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu) , 結(jié)果在局部產(chǎn)生刻蝕和穿孔, 為外源遺傳物質(zhì)進入細胞提供微通道, 這就是離子束對生物體的通道作用。其次, 用于注入的荷電正離子降低了細胞表面的負電性( 沉積作用

4、) , 從而減弱了對帶負電的外源 DNA 的靜電斥力 , 從而促進了外源 DAN的吸附和進入 , 即產(chǎn)生吸引作用。再者 , 離子束的直接和間接作用打斷細胞內(nèi)的染色體 DNA結(jié)構(gòu) , 有利于外源遺傳物質(zhì)整合到受體基因組中 , 即整合作用。芀2離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法蚈2.1注入離子類型蚆離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前所用的元素離子種類主要有2種 : N+ 和 Ar+。安徽省開展離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因較早 , 多用 Ar+作為注入離子。他們認為 Ar+是一種惰性元素 , 不會與生物靶組織發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而沉積下來 , 最終以氬氣的形式逸出靶面。卞坡等進一步研究表明 , 在相同的能量和劑量下 ,Ar+ 的刻蝕效果優(yōu)于

5、N+。但是 , 吳麗芳等研究認為 , 用相同劑量、相同能量的 N+和Ar+處理小麥成熟胚 , 結(jié)果兩種離子對小麥成熟胚出愈率的影響差異不顯著。河南省在進行外源大分子 DNA轉(zhuǎn)移時 , 多用 N+注入 , 其變異效果和三代的穩(wěn)定情況并不比用 Ar+ 的差。看來 , 拓寬離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因所用的注入元素離子的種類 , 仍是今后研究的重點。蚅2.2注入離子的能量和劑量聿注入離子的能量、劑量和脈沖劑量直接關(guān)系到離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效果。吳麗芳等研究認為 , 用離體小麥成熟胚為受體, 以GUS基因 (GFP基因 ) 為供體 , 選用的離子注入能量在 2025 keV時, 介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因效果較好。在能量為25 ke

6、V, 脈沖劑量為 2.6 × 1015 N+ /cm2 條件下 ,對小麥成熟胚進行處理 , 發(fā)現(xiàn)低劑量處理未導(dǎo)致出愈率降低 , 反而略有升高。然而 , 當(dāng)劑量大于 5 ×1016 ions/ cm2 時, 會導(dǎo)致出愈率急劇下降。他們認為 , 選用 4. 68 ×1016 ions/cm2 作為離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的注入劑量較為合適。吳麗芳等在以外源大分子裸露DNA為供體 , 成熟種子胚為受體 ( 不是離體胚 ) 時, 所用的照射能量為 30 keV, 劑量為 7 ×1016 Ar+ /cm2。萇收偉等用俄羅斯制造的 TITAN 全元素注入機 , 進行離子束輔

7、助外源 DNA轉(zhuǎn)移時 , 所用的照射能量為 30 keV, 束流 200mA,脈寬 400ms,頻率 25 Hz, 劑量為 2 ×1017 N + / cm2 。看來 , 不同的離子注入機在進行轉(zhuǎn)基因操作時 , 要摸索合適的參數(shù)條件。螈3. 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因程序肇3.1受體前的處理膃挑選成熟種子 , 進行消毒。首先用 70%的乙醇表面消毒 1 min, 用無菌雙蒸水沖洗干凈 , 接著用 0. 1% 升汞浸泡 15 min ( 或用 20%次氯酸鈉處理 30 min) , 然后用無菌雙蒸水沖洗干凈 ,用滅菌濾紙吸干水液。肂3.2離子束注入處理袈將滅菌后的種子 , 在無菌操作臺上用手術(shù)刀

8、將胚切下 , 胚朝上均勻擺放在平皿中。將無菌微環(huán)境靶室用酒精滅菌 , 放入平皿 , 種胚朝離子束方向 , 打開直通閥 , 接收離子束的刻蝕 ,待處理完后立即將種胚侵入含供體 DNA (50 g/ml) 的SSC導(dǎo)入介質(zhì)中 , 溫育 1 h 左右 , 取出種胚用 SSC溶液反復(fù)沖洗 3次 , 無菌濾紙吸干殘存水液 , 接種到 MS誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上。同時設(shè) 2 個對照 , 一個是種胚只放置在離子束注入的環(huán)境中 , 但不接受離子束注入處理 , 同樣浸入含DNA的SSC介質(zhì)中 ; 另一對照是種子胚接受和處理相同的離子束處理 , 不含 DNA的SSC溶液溫育 , 兩個對照的其它操作均相同。膄3. 3抗愈

9、傷組織的篩選及植株再生襖處理和兩個對照在 MS誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) 2天后 , 轉(zhuǎn)入含潮酶素 40 mg/L 的相同培養(yǎng)基上 , 培養(yǎng) 20天后將產(chǎn)生的小愈傷連同母體轉(zhuǎn)入含潮酶素 50mg/L的 MS繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選 , 每2 周繼代一次 , 約40天后 , 將得到的穩(wěn)定抗 50 mg/L 潮酶素的愈傷組織塊 , 轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)上進行植株再生。袀3. 4再生植株的分子檢測羈目前所報道的離子束介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物, 是用 PCR和Southern 來檢測證明受體基因組是否含有目的基因片斷。取再生植株的正常葉片, 按盧揚江等介紹的方法提取并純化植物DNA,以用作 PCR分析。反應(yīng)結(jié)束后 , 取擴增

10、產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。通過比較得到的擴增帶和預(yù)期的片段的大小來證明供體基因是否存在于被測細胞中。取少量轉(zhuǎn)基因植株的DNA酶切消化 ,然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳分離 , 按Southern 的方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上 , 用缺口轉(zhuǎn)移法對酶切消化后分離得到的供體質(zhì)粒 DNA進行放射性同位素標(biāo)記 , 并作為探針對轉(zhuǎn)移的基因組DNA進行雜交和放射自顯影分析。薄3. 5遺傳學(xué)分析莂將轉(zhuǎn)基因植株連同對照 ( 種子萌發(fā)苗 ) 栽插到田間。種子分別收獲脫粒后 , 取自交結(jié)實的轉(zhuǎn)基因植物種子進行表面消毒后 , 在含潮酶素的 MSO ( 50 mg/L) 培養(yǎng)基上發(fā)芽 , 對照組在 50mg/L的培養(yǎng)基上完全受到抑制 ,

11、 且很快死亡。而轉(zhuǎn)基因植株所獲得的潮酶素抗性性狀能夠通過種子進行后代遺傳。蕿 4. 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突出優(yōu)點肈第一 , 刻蝕和濺射作用。荷能離子對生物材料具有極強的刻蝕和濺射作用 , 使細胞形成利于外源基因進入的可修復(fù)的微通道。羅第二 , 射程的可控性和集束性。利于精確控制被處理組織細胞的刻蝕程度、損傷范圍。肄第三 , 靜電作用。帶正電離子注入細胞后 , 電荷交換使微通道積累正電荷 , 便于吸收帶負電的外源 DNA 主動進入細胞。螞第四 , 離子注入造成靶細胞 DNA鏈的損傷 , 受體細胞對損傷的 DNA的修復(fù) , 利于外源 DNA 與受體 DNA的重組與整合。膈第五 , 利用成熟種子的

12、胚和愈傷組織作為外植體 , 便于取材和批量操作 , 同時也省去了原生質(zhì)體制備和再生植株的麻煩 , 既方便又有效。莆 5. 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)作物育種上的應(yīng)用蒂水稻 : 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因這一技術(shù)首先在以水稻為受體的研究中得到了證實。余增亮等首次用離子束介導(dǎo)的方法將報告基因 GUS和CAT導(dǎo)入水稻成熟胚和懸浮細胞。楊劍波等將攜帶有報告基因 hph( 潮酶素抗性基因 ) 的質(zhì)粒 pBI222和 GUS( 2葡萄苷酸酶基因 ) 的pBI221分別導(dǎo)入水稻成熟胚和胚性懸浮細胞系中 , 獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。在轉(zhuǎn)化的懸浮細胞中 , 組織化學(xué)染色法檢測到 GUS的表達 ; 而處理的成熟胚經(jīng)潮霉素篩選得

13、到 3個穩(wěn)定的抗性細胞系 , 并分化再生出 32 株綠苗 , 其中移栽成活 25 株 ,PCR擴增檢測均得到與預(yù)期大小相同的350bp的擴增片段 , 進一步的 Southern blot 證實 , hph 基因整合到受體基因組中并穩(wěn)定遺傳。李紅將水稻幾丁質(zhì)酶基因 RCH8用此法轉(zhuǎn)入多個水稻品種中 , 獲得一批經(jīng) PCR和Southern blot 檢測的轉(zhuǎn)基因植株 , 轉(zhuǎn)基因植株葉片的細胞粗提液表現(xiàn)出抑制被孢霉生長的作用。莁最近 , 安徽省農(nóng)科院抗菌肽 shiva 基因?qū)胨净謴?fù)系明恢 63熟胚中 , 經(jīng)愈傷誘導(dǎo)和綠苗再生 , PCR檢測分析證明 , 外源基因已整合到再生植株的基因組中。通過

14、離子束介導(dǎo)法將紫玉米的總 DNA導(dǎo)入水稻品種早秈 213, 經(jīng)連續(xù) 6年 12代的選育 , 獲得了一批穩(wěn)定遺傳的變異株系 , 不僅根系發(fā)達 , 而且在莖干等部位表現(xiàn)出供體玉米的紫色性狀。測定了其中農(nóng)藝性狀較好的 8個株系的光合速率 , 平均比早秈 213提高 84%。用 40個隨機引物對上述 8個玉米稻株系以及早秈 213和紫玉米的基因組 DNA 進行 RAPD分析 , 玉米稻 DNA的RAPD擴增帶和早秈 213 的相似性很高 , 但存在明顯差異 , 出現(xiàn)來自玉米 DNA的“目的帶” , 提示玉米 DNA可能已經(jīng)整合到受體的基因組中。膇小麥 : 吳麗芳將水稻幾丁質(zhì)酶基因在氬離子介導(dǎo)下注入小麥

15、, 得到高效表達幾丁質(zhì)酶的小麥植株。在此基礎(chǔ)上 , 將改良的綠色熒光蛋白基因(mGFP4)導(dǎo)入小麥栽培品種皖 9210和皖麥 32的成熟胚細胞。在含有 100120mg/L巴龍霉素培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后 , 獲得了一批抗性愈傷組織。經(jīng)過分化培養(yǎng) , 獲得再生苗。對再生苗進行 PCR 檢測 , 均擴增出 600bp的 npt 基因片段。取 4株長勢好的綠苗進行 Southern 雜交分析 , 結(jié)果表明 , 這 4株綠苗皆為轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù) PCR分析結(jié)果統(tǒng)計 , 皖9210和皖麥 32號的平均植株轉(zhuǎn)化率分別是 1.3%和 4.1%。用同樣的方法將水稻幾丁質(zhì)酶基因 RCH8轉(zhuǎn)入小麥品種皖 9219和皖

16、麥 32的成熟胚中 , 經(jīng)抗性篩選的再生植株當(dāng)代 (R0) 及R1代均擴增出預(yù)期大小的 DNA片段 ,Southern 雜交證實外源基因已經(jīng)整合到小麥基因組中； R1代葉片的細胞粗提液對小麥赤霉病菌株 F 0 和F15有明顯的抑制作用 , 說明外源基因在受體中穩(wěn)定遺傳。螇其他作物 : 日本原子能研究所于 1998年用碳離子 ( 大氣環(huán)境中 ) 介導(dǎo)將 PCH基因轉(zhuǎn)入干的花粉細胞。將基因轉(zhuǎn)入花粉比轉(zhuǎn)入裸露的細胞更加困難 , 因為花粉細胞為雙層壁結(jié)構(gòu)。同時 , 本實驗首次嘗試將束流引入室外 , 在大氣環(huán)境中對生物材料進行注入。芄此后 , 科學(xué)家們進一步深入研究, 轉(zhuǎn)移的外源基因也從以前的報告基因最

17、終轉(zhuǎn)向目的基因。卞坡等利用 30KeV的離子束在 1.5 ×1017ions/cm2 的注入劑量下介導(dǎo)外源甘藍全DNA導(dǎo)入模式植物擬南芥菜 , 在94株轉(zhuǎn)化當(dāng)代植株中 , 有 6株表型產(chǎn)生變異。宋道軍等以氯化鈣制備感受態(tài)受體細胞轉(zhuǎn)移法為對照 , 用離子束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) , 將具有高效 DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的耐輻射異常球菌 (D.radiodurans) 的基因組 DNA片段轉(zhuǎn)入對紫外 (UV) 輻照敏感的大腸桿菌中。膀結(jié)果表明 , 轉(zhuǎn)入 DNA后的菌株對 UV輻射的抗性不僅高于其對應(yīng)的敏感菌株 , 而且也高于其對應(yīng)的敏感菌株的產(chǎn)生菌株 , 表現(xiàn)為 : 轉(zhuǎn)入 DNA后的菌株受紫外輻照的

18、存活率明顯提高 ,代表修復(fù)合成的非按期 DNA合成 (UDS)能力大為增強。中國科學(xué)院等離子體物理研究所與安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院合作 , 用粒子束介導(dǎo)法將紫色玉米全 DNA轉(zhuǎn)入水稻 , 獲得了 3個玉米稻新品系 , 在區(qū)域試驗后將大范圍推廣。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)用比克氏棉和紅麻DNA轉(zhuǎn)化泗棉 2號, 獲得了高抗枯萎病的棉花新品系。在這些實驗中, 轉(zhuǎn)移的外源 DNA能夠整合到受體基因組中, 并能夠在后代中穩(wěn)定遺傳。宋道軍等將銀杏DNA導(dǎo)入西瓜品種 3 16和SR 221422中, 銀杏內(nèi)酯在西瓜品種 3 16和SR221422的轉(zhuǎn)化當(dāng)代葉片中的表達量分別為17.0756 g/g 和45.9998 g/g;

19、有銀杏內(nèi)酯表達的兩個月齡西瓜葉片超氧化物岐化酶活性, 也分別比對照提高了近一倍 , 表明獲得了供體植物多基因在受體中的表達。離子束介導(dǎo)外源基因組DNA導(dǎo)入受體 ,可以篩選到帶有目的性狀的轉(zhuǎn)化后代 , 為遠緣和超遠緣物種間遺傳物質(zhì)交流提供了一種新的有效途徑 , 且可以實現(xiàn)多基因的轉(zhuǎn)移和表達 , 顯示出在農(nóng)作物育種上的美好應(yīng)用前景。芇6. 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀襖從目前的研究現(xiàn)狀來看 , 在利用低能離子束生物技術(shù)進行外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中 , 主要包括 2個方面的研究內(nèi)容 , 即低能離子束介導(dǎo)目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化和離子束介導(dǎo) DNA大片段的遺傳轉(zhuǎn)化。大量的研究結(jié)果已經(jīng)證實 , 低能離子束對生物體

20、細胞的超微加工使得細胞的通透性會發(fā)生明顯的改變 ; 通過對照射劑量進行控制 , 可以在細胞和組織上形成可修復(fù)的微孔 , 這為外源遺傳物質(zhì)進入細胞提供了良好的通道。螞經(jīng)過近 20年的不斷研究和探索 , 在離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展過程中, 離子束介導(dǎo)作用的異源遺傳物質(zhì)重組效應(yīng)已經(jīng)被越來越多的試驗結(jié)果所證實 , 其實用性和普遍性也已經(jīng)被相關(guān)領(lǐng)域的研究者所肯定 , 一些簡單的生物學(xué)問題已經(jīng)被闡明 , 一些實用性技術(shù)體系已經(jīng)建立并不斷得到完善。然而 , 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在今后的發(fā)展中仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn) , 還有一些更引人注目的問題值得研究 , 今后在該領(lǐng)域內(nèi)的研究難度會隨著研究的不斷深入而越來越

21、大。此領(lǐng)域迫切需要建立一個更加完善的物理技術(shù)平臺 , 急待形成一個更加完整的研究體系。有必要借助于其他學(xué)科的新技術(shù)或新工藝形成一個相互補充的技術(shù)集成體系 , 更應(yīng)該將離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實用性和普遍性的范圍不斷地拓寬。罿7. 問題與展望莇雖然離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法在外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移方面獲得極大的成功 , 但這一新興的技術(shù)還有待于進一步完善。從近 10多年來離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究結(jié)果來看 , 學(xué)科內(nèi)的研究資料尚缺乏系統(tǒng)性和完整性 , 即研究項目所涉及到的生物種類比較多 , 但對每一種生物的研究深度還比較膚淺 ; 對某些生物物種內(nèi)特定材料研究的比較多 , 而忽視了統(tǒng)一生物物種的不同基因型對離子

22、束介導(dǎo)作用會表現(xiàn)不同的生物學(xué)效應(yīng)；在通過離子束介導(dǎo)外源遺傳物質(zhì)對生物受體進行遺傳改良的過程中 , 對其后代的表現(xiàn)型效應(yīng)研究的比較多 , 而對其細胞學(xué)機理、生理生化基礎(chǔ)和分子生物學(xué)機制的研究比較少。目前的裝置需要在真空下進行離子注入 , 而真空的脫水作用和真空導(dǎo)致的凍害 , 使注入后細胞或組織的存活率大大下降。不僅嚴重影響轉(zhuǎn)化的效率 , 而且限制了在動物和以無性繁殖為主的果木和蔬菜上的應(yīng)用。對于不同的物種、不同基因型的材料 , 還需確定其適宜的轉(zhuǎn)化參數(shù)。此外 , 國內(nèi)進行離子注入所用的劑量單位是 ions/ cm2 , 并非國際通用的計量單位 , 造成這一具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新技術(shù)較難在國外優(yōu)秀刊

23、物上發(fā)表。改進裝置 , 將離子束流引出真空是解決問題的關(guān)鍵 , 應(yīng)建造一臺能量更高、能引出外束的新裝置。在目前條件下 , 為提高轉(zhuǎn)基因效率和擴大受體范圍 , 離子注入前用冷凍保護劑預(yù)處理是行之有效的方法。芅由于低能離子束具有質(zhì)荷能協(xié)同作用下的特殊生物學(xué)效應(yīng) , 它已在生物品種改良、生命起源和進化以及環(huán)境輻射生物學(xué)效應(yīng)等多個理論和應(yīng)用研究領(lǐng)域中獲得長足發(fā)展。通過離子束介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移已獲得了一大批生物優(yōu)良品系 , 取得了顯著的社會經(jīng)濟效益 , 應(yīng)用前景十分廣闊。作為一門新的交叉學(xué)科 , 低能離子生物學(xué)將隨著研究的不斷深入 , 進一步完善其理論體系 , 拓展其應(yīng)用研究領(lǐng)域 , 開創(chuàng)新的研究局面?？?/p>

24、以預(yù)見 , 隨著離子束生物技術(shù)的不斷發(fā)展 , 離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將在更多的生物上得到應(yīng)用 , 在外源基因組 DNA轉(zhuǎn)移方面取得突破性進展。知識創(chuàng)新工程為這一領(lǐng)域的發(fā)展提供了極好的機遇 , 相信在生物學(xué)家和物理學(xué)家的共同努力下 , 這一領(lǐng)域的發(fā)展前景將會更加廣闊。莄參考文獻 :羂1 余增亮 . 離子束與生命科學(xué)一個新的研究領(lǐng)域 J.物理 ,1997,26(6): 333-338.蕆2Yu Z L,Deng J G, He J J , et al. Mutation breeding by ion im2p lantation J.Nuclear Instruments and Methods

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