1、納豆芽孢桿菌發酵聚谷氨酸過程中納豆芽孢桿菌發酵聚谷氨酸過程中專專 業：業： * * * * * *研研 究究 生：生： * * * * * *指導老師：指導老師： * * * * * * 教教 授授 * * * * * * 副教授副教授 二一四年五月二十二日二一四年五月二十二日谷氨酸脫氫酶鈣調機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調機制研究陜西師范大學碩士畢業論文答辯陜西師范大學碩士畢業論文答辯匯報內容匯報內容研究背景與意義研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4結論與展望結論與展望5研究

2、背景與意義研究背景與意義1研究背景與意義研究背景與意義 -PGA是由是由L-谷氨酸谷氨酸(L-glutamic acid)或或D-谷氨酸谷氨酸(D-glutamic acid)單體單體通過通過 -氨基與氨基與 -羧基縮合而成的多肽羧基縮合而成的多肽分子，其結構式如圖所示。分子，其結構式如圖所示。微生物發酵法化學合成法(-PGA、-PGA) -PGAL-GluD-Glu+OHOOHOHH2NOHOOHOH2NHH2NHNNHOHOHOHOHOOOOOOn微生物微生物發酵發酵聚谷氨酸聚谷氨酸概述概述研究研究背景與意義背景與意義 安全、無味、可食用安全、無味、可食用 超超強吸水性強吸水性(5000倍

3、倍) 可螯合金屬可螯合金屬 生物可降解性生物可降解性 對腸道酶不敏感對腸道酶不敏感聚谷氨酸在食品中的應用聚谷氨酸在食品中的應用n礦物元素吸收促進劑；食品抗凍劑；食用膠囊；遮蓋改變不礦物元素吸收促進劑；食品抗凍劑；食用膠囊；遮蓋改變不良味覺；食品穩定劑；增稠劑等。良味覺；食品穩定劑；增稠劑等。n-PGA可以改變食品的可以改變食品的生理特性、物理特性和味覺功能生理特性、物理特性和味覺功能，基，基于以上特性，其作為配料在食品加工業具有很大的發展潛力，如于以上特性，其作為配料在食品加工業具有很大的發展潛力，如應用于果汁、面包、蛋糕、意大利面等。應用于果汁、面包、蛋糕、意大利面等。研究研究背景與意義背景

4、與意義聚谷氨酸產生菌聚谷氨酸產生菌納豆食品納豆激酶聚谷氨酸 -PGA發現于發現于1937年，從一種致病的革蘭氏陽性細菌年，從一種致病的革蘭氏陽性細菌炭疽芽孢桿菌炭疽芽孢桿菌的的莢膜中分離得到。其后發現了多種芽孢桿菌均能產生這種物質，主要包括莢膜中分離得到。其后發現了多種芽孢桿菌均能產生這種物質，主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短小芽枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。由于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的易培養性和生物安全性，目孢桿菌。由于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的易培養性和生物安全性，目前對于這兩種菌生產前對于這兩種菌生產-P

5、GA的研究報道較多。的研究報道較多。 在聚谷氨酸的發酵生產中，在聚谷氨酸的發酵生產中，納豆芽孢桿菌納豆芽孢桿菌作為一類從納豆發酵食品中作為一類從納豆發酵食品中分離出來的主要菌株，在生產食品級分離出來的主要菌株，在生產食品級-PGA中發揮了巨大的作用。中發揮了巨大的作用。納豆芽孢桿菌研究研究背景與意義背景與意義金屬離子對聚谷氨酸發酵的影響金屬離子對聚谷氨酸發酵的影響金屬離子金屬離子生產菌株生產菌株調控作用調控作用MnMn2+2+B. licheniformis B. licheniformis NCIMB 11709NCIMB 11709、B.subtilisB.subtilis NX-2 NX

6、-2產生不同程度的產生不同程度的-PGA-PGA的的D-D-異構體；異構體；延長細胞活力延長細胞活力K K+ +Bacillus sp. Bacillus sp. RKY3RKY3激發菌體細胞的生長及激發菌體細胞的生長及-PGA-PGA的產生的產生MgMg2+2+Bacillus sp. Bacillus sp. RKY3RKY3激發菌體細胞的生長及激發菌體細胞的生長及-PGA-PGA的產生的產生NaNa+ +B. subtilisB. subtilis chungkookjungchungkookjung有效減少泡沫，降低粘度，改善溶氧及傳質；有效減少泡沫，降低粘度，改善溶氧及傳質；降低降低

7、-PGA-PGA的分子量大小的分子量大小CaCa2+2+Bacillus subtilisBacillus subtilis HSF 1410HSF 1410降低降低-PGA-PGA發酵液的粘度；提高發酵液的粘度；提高-PGA-PGA產量；產量；不會引起不會引起-PGA-PGA分子量的變化分子量的變化表表1-1 1-1 不同金屬離子對發酵的調控作用不同金屬離子對發酵的調控作用研究研究背景與意義背景與意義 L-Glu L-Glu主要是由主要是由-酮戊二酸和酮戊二酸和NHNH4 4+ +由由GDHGDH催化合成，接著，催化合成，接著，ATPATP被谷被谷氨酸依賴的氨酸依賴的ATPATP水解酶水解為

8、水解酶水解為ADPADP和和PiPi，然后磷酸基團結合到小分子，然后磷酸基團結合到小分子- -PGAPGA的的C-C-末端，之后末端，之后D-D-或者或者L-L-谷氨酸谷氨酸的氨基端與的氨基端與C C端磷酸化了的小分子端磷酸化了的小分子-PGA-PGA發生親核攻擊，生成發生親核攻擊，生成PiPi并延并延伸伸-PGA-PGA鏈鏈。 前期研究發現，前期研究發現，CaCa2+2+添加后，添加后，菌體內菌體內-酮戊二酸節點上的谷氨酸酮戊二酸節點上的谷氨酸脫氫酶與未加入脫氫酶與未加入CaCa2+2+相比，相比，酶活顯著酶活顯著提高提高，因此，因此-酮戊二酸更多地流向酮戊二酸更多地流向了與了與NHNH4

9、4+ +形成谷氨酸，合成更多的形成谷氨酸，合成更多的-PGA-PGA。谷氨酸依賴的谷氨酸依賴的ATPATP酶酶PGAPGA聚合酶聚合酶聚谷氨酸的生物合成途徑聚谷氨酸的生物合成途徑圖1-1 -PGA生物合成途徑谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶研究研究背景與意義背景與意義-酮戊二酸酮戊二酸+NH3+NAD(P)H L-谷氨酸谷氨酸+NAD(P)（NADH，NADPH，NAD(P)H三三種種輔酶依賴型輔酶依賴型）GDHGDH活性調活性調控控磷酸化磷酸化-去磷去磷酸化酸化產朊假絲產朊假絲酵母酵母釀酒酵母釀酒酵母E.coli酶修飾酶修飾多形擬桿菌多形擬桿菌編碼基因編碼基因roc G編碼編碼有活性有活性gud B

10、編碼編碼無活性無活性Bacillus subtilis 谷氨酸脫氫酶微生物調控機制谷氨酸脫氫酶微生物調控機制研究研究背景與意義背景與意義鈣離子可以調控谷氨酸脫氫酶活性鈣離子可以調控谷氨酸脫氫酶活性 鈣是重要的胞內第二信使，鈣調節作用鈣是重要的胞內第二信使，鈣調節作用主要通過鈣結合蛋白來實現。主要通過鈣結合蛋白來實現。 CaCa2+2+介入了介入了蛋白分泌，細胞運動，中間代謝，離子通道活性和基蛋白分泌，細胞運動，中間代謝，離子通道活性和基因表達等生命過程因表達等生命過程。 鈣離子鈣離子在在生物體內合成代謝中生物體內合成代謝中，可影響，可影響GDHGDH的活性。的活性。 在有在有1mM1mM鈣離子

11、存在下，鈣離子存在下，NADPH-GDHNADPH-GDH被激活被激活（L-L-谷氨酸合成方谷氨酸合成方向）向），而，而NADH-GDHNADH-GDH（L-L-谷氨酸分解方向）谷氨酸分解方向）被抑制，被抑制，- -酮戊二酸酮戊二酸的氨基化反應的平衡，隨之轉變的氨基化反應的平衡，隨之轉變。 一種擁有一段一種擁有一段EF-loopEF-loop修飾區，具有明修飾區，具有明顯的顯的CaCa調節蛋白的特征的調節蛋白的特征的GDHGDH已經被發現已經被發現。 谷氨酸脫氫酶活性谷氨酸脫氫酶活性調控機制復雜，不同調控機制復雜，不同菌種中調控機制不同菌種中調控機制不同 Bacillus subtilis n

12、atto 中谷氨酸脫氫酶中谷氨酸脫氫酶活性調控機制目前尚活性調控機制目前尚無研究無研究立題依據立題依據-PGA是一種由微生物發酵生產而得的高分子物質，具有良好是一種由微生物發酵生產而得的高分子物質，具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性，因此在食品、農業、化妝的水溶性、生物相容性和生物可降解性，因此在食品、農業、化妝品、制藥業以及環保等領域應用非常的廣泛品、制藥業以及環保等領域應用非常的廣泛。國內微生物發酵法生產規模小，成本高，發酵水平低，造成國內微生物發酵法生產規模小，成本高，發酵水平低，造成-PGA產品價格昂貴，嚴重制約著這種生物高聚物的實際應用水平。產品價格昂貴，嚴重制約著這種生物高

13、聚物的實際應用水平。因此，如何降低因此，如何降低-PGA生產成本、提高生產成本、提高-PGA的產量，是目前的產量，是目前-PGA研究領域中的重要課題之一。研究領域中的重要課題之一。該研究以該研究以-PGA合成中底物谷氨酸供給調控機制為突破口，打合成中底物谷氨酸供給調控機制為突破口，打破以往局限于破以往局限于-PGA合成酶及其調控的研究策略，不僅可初步闡明合成酶及其調控的研究策略，不僅可初步闡明鈣調節鈣調節GDH活性和谷氨酸合成機制，而且為活性和谷氨酸合成機制，而且為-PGA合成機制研究提合成機制研究提供更廣泛的理論和實驗證據，也有利于為進一步提高供更廣泛的理論和實驗證據，也有利于為進一步提高-

14、PGA合成水合成水平提供人為控制的技術策略。平提供人為控制的技術策略。匯報內容匯報內容研究背景與意義研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4結論與展望結論與展望5谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證Strains/plasmidDescriptionSource/referenceB. subtilis HSF 1410Isolated from “natto”黃柏黃柏祺祺, 2010E. coli DH5F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 gy

15、rA96 deoR nupG 80dlacZM15 (lacZYA-argF)U169 hsdR17(rK-mK+) Hanahan, 1985E. coli BL21(DE3)F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) (DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)Studier, F. W., 1986plasmidspET28a(+)Express vector Kmr T7lac His-Tag(N,C) T7-tag11(I) thrombin陜西省微生物研究陜西省微生物研究所萬一研究員所萬一研究員T-Vector pMD

16、19 (Simple)Clone vector AprTakara表表2-1 菌株與質粒菌株與質粒實驗材料實驗材料梯度梯度PCR儀儀 Applied Biosystems公司公司高速離心機（高速離心機（1-14型）型） Sigma公司公司超低溫冰箱超低溫冰箱 Thermo公司公司電轉化儀（電轉化儀（AG 22331型）型） Eppendorf公司公司超聲波細胞破碎儀（超聲波細胞破碎儀（JY92-IID型）型） 寧波新芝生物科技股份有限公司寧波新芝生物科技股份有限公司電泳儀（電泳儀（DYY-6C型）型） 北京市六一儀器廠北京市六一儀器廠旋渦混合器（旋渦混合器（XW-80A型）型） 海門市其林貝雨

17、儀器制造有限公司海門市其林貝雨儀器制造有限公司培清凝膠成像分析儀（培清凝膠成像分析儀（JS-680B型）型） 上海培清科技有限公司上海培清科技有限公司恒溫培養箱（恒溫培養箱（GSP-9080MBE型）型） 山海博訊實業有限公司醫療設備廠山海博訊實業有限公司醫療設備廠谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證實驗儀器與設備實驗儀器與設備谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證構 建 過 程 ：構 建 過 程 ： P C R 獲 得獲 得gdhA基因，基因，TA克隆于克隆于T載體載體中；將表達載體與含目的片中；將表達載體與含目的片段的段的T載體分別經雙酶切，載體分別經雙酶切，T4連接酶過夜連

18、接得到含目連接酶過夜連接得到含目的基因的重組質粒。的基因的重組質粒。體外表達：體外表達：將重組質粒電將重組質粒電擊導入大腸桿菌擊導入大腸桿菌BL 21宿主菌宿主菌中，經中，經IPTG誘導表達目的蛋誘導表達目的蛋白，白，SDS-PAGE法驗證目的法驗證目的蛋白的表達。蛋白的表達。圖2-1 pET28a/gdhA構建過程示意圖實驗方法實驗方法谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證結果與分析結果與分析1. 1. gdhgdhA A克隆、生物信息學分析及載體構建克隆、生物信息學分析及載體構建對對pET28a/gdhA雙酶切，出現兩條雙酶切，出現兩條DNA片段，一條是片段，一條是pET28a載體片

19、段（約載體片段（約5.3kb），），一條是一條是gdhA谷氨酸脫氫酶基因片段（約谷氨酸脫氫酶基因片段（約1.3kb）。）。生物信息學顯示，此生物信息學顯示，此gdhA谷氨酸脫氫酶基因有谷氨酸脫氫酶基因有1275個堿基，可編碼個堿基，可編碼424個氨基酸殘個氨基酸殘基，蛋白分子式基，蛋白分子式C2084H3312N570O630S19，分子量，分子量47.05kDa，等電點，等電點5.58，總原子數，總原子數6615，脂溶指數脂溶指數87.59，疏水性平均值，疏水性平均值-0.255，是一個，是一個親水性蛋白親水性蛋白。圖2-2 基因組提取、gdhA PCR擴增與重組質粒雙酶切電泳圖谷氨酸脫氫酶

20、基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證圖2-3 gdhA蛋白質二級結構分析圖 結果：結果： gdhA蛋白序列中，蛋白序列中，-螺旋螺旋192個，沒有個，沒有-螺旋，延伸鏈螺旋，延伸鏈68個，個，-轉角轉角36個，其余為無規則卷曲個，其余為無規則卷曲128個。個。 分析：分析：預測表明該蛋白的二級結構主要為預測表明該蛋白的二級結構主要為螺旋和無規則卷曲螺旋和無規則卷曲。谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2. 2. gdhgdhA A基因的體外誘導表達基因的體外誘導表達結果：結果： E. coli BL 21表達宿主成功目的蛋白，且目的蛋白的表達量隨著誘導表達宿主成功目的蛋白，且目的蛋白的表達

21、量隨著誘導時間的增長而增加，而未經誘導的菌體內不含該目的蛋白。該誘導表達蛋白分時間的增長而增加，而未經誘導的菌體內不含該目的蛋白。該誘導表達蛋白分子量約子量約47kDa，與，與gdhA谷氨酸脫氫酶的分子量（谷氨酸脫氫酶的分子量（47.05kDa）大小一致。）大小一致。分析：分析：證明該目的蛋白的編碼基因證明該目的蛋白的編碼基因gdhA為正確的谷氨酸脫氫酶基因為正確的谷氨酸脫氫酶基因。圖2-4 IPTG誘導后菌體全蛋白電泳圖谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證小結與討論小結與討論（1）成功從納豆芽孢桿菌）成功從納豆芽孢桿菌HSF 1410中克隆得到中克隆得到gdhA谷氨酸脫氫谷氨酸脫氫酶

22、基因，基因全長酶基因，基因全長1,275bp，GC含量含量44.16%。序列比對發現該基因。序列比對發現該基因與與NCBI上報道的上報道的Bacillus subtilis subsp. natto gudB谷氨酸脫氫酶序列谷氨酸脫氫酶序列具有具有100%同源性。同源性。（2）構建重組表達質粒構建重組表達質粒pET28a/gdhA，成功，成功于大腸桿菌于大腸桿菌BL 21中中進行進行gdhA目的蛋白的表達，蛋白表達水平隨著時間的增長而增大。目的蛋白的表達，蛋白表達水平隨著時間的增長而增大。所獲得的目的蛋白分子量與預測的所獲得的目的蛋白分子量與預測的gdhA編碼蛋白分子量相一致，確編碼蛋白分子量

23、相一致，確證證gdhA確為谷氨酸脫氫酶基因。確為谷氨酸脫氫酶基因。（3）可在此基礎上繼續進行融合蛋白的純化與酶活驗證實驗，以）可在此基礎上繼續進行融合蛋白的純化與酶活驗證實驗，以確認所得到的目的蛋白具有谷氨酸脫氫酶活性為宜。確認所得到的目的蛋白具有谷氨酸脫氫酶活性為宜。 匯報內容匯報內容研究背景與意義研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4結論與展望結論與展望5谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究（1）液體種子培養基：液體）液體種子培養基：液體LB培養基，培

24、養基，pH7.0，121蒸汽滅菌蒸汽滅菌20min；（2）發酵培養基：葡萄糖）發酵培養基：葡萄糖20g/l，谷氨酸鈉，谷氨酸鈉10g/l，NH4Cl 1g/l，酵母粉，酵母粉1g/l，K2HPO4 3g/l，MgSO4 0.2g/l，pH7.0，121 蒸汽滅菌蒸汽滅菌20 min。培養基培養基實驗儀器與設備實驗儀器與設備UV-Vis分光光度計（分光光度計（TU-1810型）型） 北京普析通用儀器有限責任公司北京普析通用儀器有限責任公司PikoReal real-time PCR system 美國美國Thermo公司公司微量核酸蛋白測定儀（微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop ND 2000

25、型）型） 美國美國Thermo公司公司其他儀器及設備見第二章其他儀器及設備見第二章 2.1.2。谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究實驗技術路線實驗技術路線Ca2+GDH活性體外激活角度：體外激活角度：Ca2+可能可能直接與直接與GDH蛋白發生作用，使酶構象發蛋白發生作用，使酶構象發生改變而提高其活性生改變而提高其活性體內調控角度：體內調控角度：Ca2+可能可能增加增加了編了編碼谷氨酸脫氫酶基因的表達碼谷氨酸脫氫酶基因的表達量，使量，使得酶活性提高得酶活性提高推測與假設推測與假設谷氨酸脫氫酶鈣調機制谷氨酸脫氫酶鈣調機制體外激體外激活角度活角度破碎發酵破碎發酵菌體獲得菌體獲得粗酶

26、液粗酶液分析鈣離子對分析鈣離子對GDHGDH活性的直接影響，活性的直接影響，明確鈣離子對明確鈣離子對GDHGDH的體外調節可能性的體外調節可能性體內調體內調控角度控角度于粗酶液中加于粗酶液中加入不同濃度鈣入不同濃度鈣離 子 ， 測 定離 子 ， 測 定GDHGDH活性變化活性變化發酵過程發酵過程中添加不中添加不同濃度鈣同濃度鈣離子離子分析鈣離子濃度與分析鈣離子濃度與gdhgdhA A的轉錄響應關的轉錄響應關系，明確鈣離子對系，明確鈣離子對GDHGDH表達量的影響表達量的影響提 取 菌 體 總提 取 菌 體 總RNA,RNA,實時定量實時定量PCRPCR分析分析gdhgdhA A的轉錄水平的轉錄

27、水平谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究破碎發酵菌體破碎發酵菌體獲得粗酶液，獲得粗酶液，測定測定GDHGDH活性活性變化變化分析鈣離子在發酵分析鈣離子在發酵過程中對過程中對GDHGDH活性活性的影響的影響谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究結果與分析結果與分析圖3-1 粗酶液中添加不同濃度CaCl2時GDH活性0408012016020024000.050.10.150.2CaCl2 concentration /GDH activity U/mg結果：結果：GDH比活力均比活力均在在190U/mg左右，方差分左右，方差分析后可知，添加不同濃度析后可知，添加不同

28、濃度Ca2+對粗酶液中谷氨酸脫對粗酶液中谷氨酸脫氫酶活性變化影響不顯著氫酶活性變化影響不顯著（p=0.934 0.05）。）。分析：分析：鈣離子對鈣離子對GDH沒有體外直接激活作用。沒有體外直接激活作用。1. 1. 鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體外調節作用鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體外調節作用谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究2. 2. 鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體內調節作用鈣離子對谷氨酸脫氫酶的體內調節作用（1 1）不同鈣離子濃度下谷氨酸脫氫酶酶活分析）不同鈣離子濃度下谷氨酸脫氫酶酶活分析圖3-2 發酵液中添加不同濃度CaCl2時GDH活性結果：結果：隨著隨著Ca2+濃度濃度不斷增大，不

29、斷增大，GDH比活力比活力逐步升高。逐步升高。方差分析可知，方差分析可知，發酵過程中添加不同濃度發酵過程中添加不同濃度Ca2+對對GDH活性變化影活性變化影響顯著（響顯著（p=0.0000.05）。）。分析：分析：猜測猜測Ca2+在生在生物體內調節了物體內調節了GDH基因基因的轉錄水平，使得酶的表的轉錄水平，使得酶的表達量提高。達量提高。07014021028035042000.050.10.150.2CaCl2 concentration /GDH activity U/mg谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究（2 2）不同鈣離子濃度下）不同鈣離子濃度下gdhA A基因表達水

30、平分析基因表達水平分析GeneName of primers(site)Sequence(5-3)ProductsizeProgrammed annealingtemperaturegapdh（reference）P3(569)TTCCGCACAAAGACTACCG134bp60P4(702)AACACGCATTGCTCCACCgdhA（target）P5(166)CGTATGGACGACGGTTCAGTTA123bp60P6(288)CGCCTTCACCTCTTTTTCTGTT本實驗選本實驗選取取gapdh作為內參基因作為內參基因。根據納豆芽孢桿菌。根據納豆芽孢桿菌gapdh基因及基因及gd

31、hA谷氨酸脫氫酶基因序列采用谷氨酸脫氫酶基因序列采用Primer5.0軟件對引物進行設計和分析，軟件對引物進行設計和分析，具體序列見下表。具體序列見下表。表表3-1 PCR引物及其引物及其PCR產物大小產物大小谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究 總總RNA提取及引物退火溫度優化實驗提取及引物退火溫度優化實驗圖3-3 總RNA電泳圖圖3-4 gapdh基因和gdhA的PCR產物對提取的總對提取的總RNA進行甲醛變性膠電泳，進行甲醛變性膠電泳，23S及及16S條帶清晰完整，說明提條帶清晰完整，說明提取的取的RNA完整性很好。完整性很好。Tm=60時，分別對時，分別對gapdh，g

32、dhA基因進行擴增，產物條帶清晰，長度正基因進行擴增，產物條帶清晰，長度正確，無引物二聚體。驗證確，無引物二聚體。驗證引物特異性良好，退火溫度適宜引物特異性良好，退火溫度適宜。谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究 擴增效率測定擴增效率測定基因名基因名線性回歸方程線性回歸方程R2擴增擴增效率效率gapdhY=-3.338X+43.079 0.996999.336%gdhAY=-3.423X+33.538 0.998395.955%表表3-2 內參及目的基因相對標準曲線內參及目的基因相對標準曲線圖3-5 相對標準曲線、擴增曲線及熔解曲線結果：結果：PCR體系穩定，引物體系穩定，引物

33、擴增效率高，實驗重復性好。熔擴增效率高，實驗重復性好。熔解曲線單一峰，峰型尖銳無雜峰，解曲線單一峰，峰型尖銳無雜峰，說明定量說明定量PCR體系結果真實可靠體系結果真實可靠。分析：分析：兩基因擴增效率均在兩基因擴增效率均在95-105%范圍內，相差不大，表范圍內，相差不大，表明可以采用相對定量的方法測定明可以采用相對定量的方法測定目的基因的相對表達量。目的基因的相對表達量。谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究 鈣離子對鈣離子對gdhA谷氨酸脫氫酶基因轉錄水平的影響谷氨酸脫氫酶基因轉錄水平的影響圖3-6 不同CaCl2濃度組gdhA相對表達量圖3-7 gdpdh與gdhA擴增曲線及

34、熔解曲線00.40.81.21.6200.050.10.150.2gdhA relative expression CaCl2 concentration / 結果：結果：CaCl2濃度分別為濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2（w/v）時，）時，gdhA相對相對表達量之比為：表達量之比為：1:1.18:1.27:1.57:1.76。分析：分析：證實了猜想證實了猜想Ca2+可在菌體生長過程中進入細胞內，通過調控可在菌體生長過程中進入細胞內，通過調控gdhA的的mRNA轉錄水平，增加轉錄水平，增加GDH在菌體中的表達量，使酶活性提高。在菌體中的表達量，使酶活性提高。谷氨酸脫氫酶鈣調節

35、機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究小結與討論小結與討論（1）考察了）考察了Ca2+對對GDH的體外調節作用。結果表明的體外調節作用。結果表明Ca2+對對GDH沒有體外的直接激活作用。沒有體外的直接激活作用。（2）考察了）考察了Ca2+對對GDH的體內調節作用。一方面，酶活性測定的體內調節作用。一方面，酶活性測定結果顯示結果顯示Ca2+可在生物體內調控可在生物體內調控GDH酶活性。另一方面，酶活性。另一方面，gdhA相對相對表達量測定結果不僅驗證了酶活性測定結果，同時表明了表達量測定結果不僅驗證了酶活性測定結果，同時表明了Ca2+是在是在細胞內調控了細胞內調控了gdhA的轉錄水平，增加了該基因在

36、菌體中的表達量，的轉錄水平，增加了該基因在菌體中的表達量，使酶活性提高。使酶活性提高。（3）實驗從）實驗從Ca2+可能的調控方式著手，通過體外、體內兩方面研可能的調控方式著手，通過體外、體內兩方面研究其對究其對GDH活性的影響，為研究酶活性的調控機制提供了一種新策活性的影響，為研究酶活性的調控機制提供了一種新策略。略。匯報內容匯報內容研究背景與意義研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4結論與展望結論與展望5鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用材料與儀器材料與儀器全

37、自動氨基酸分析儀（全自動氨基酸分析儀（L-8900L-8900型）型） 日本日本HITACHIHITACHI公司公司其余實驗材料和儀器均參考第三章。其余實驗材料和儀器均參考第三章。實驗方法實驗方法消解液消解液的制備的制備不同濃度不同濃度鈣離子發鈣離子發酵培養酵培養取取200200L L消解液消解液氮氣吹干，氮氣吹干，0.2M0.2M鹽酸定容至鹽酸定容至5mL5mL，過濾后進樣分析過濾后進樣分析取上清發酵取上清發酵液加入濃鹽液加入濃鹽酸酸110110消消解解22h22h1.1.生物量的測定：生物量的測定：ODOD6006002.-PGA2.-PGA產量及產量及NHNH4 4ClCl消耗量測定消耗

38、量測定上述離心后的上述離心后的上清發酵液上清發酵液適當稀釋后直接過適當稀釋后直接過濾，進樣分析濾，進樣分析未消解液未消解液的制備的制備通過計算獲得通過計算獲得- - PGAPGA產量和產量和NHNH4 4ClCl消耗量消耗量鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用結果與分析結果與分析1. 1. 鈣離子對發酵液中菌體生物量的影響鈣離子對發酵液中菌體生物量的影響00.40.81.21.6200.050.10.150.2OD600CaCl2 concentration /圖4-1 不同CaCl2濃度組對發酵液中生物量的影響結果：結果：隨著隨著Ca2+濃度濃度的升高發酵液中生物量不的升高發酵液中生

39、物量不斷下降。這說明斷下降。這說明Ca2+對納對納豆芽孢桿菌的生長繁殖具豆芽孢桿菌的生長繁殖具有逆影響。有逆影響。分析：分析：生物量也是影生物量也是影響響-PGA產量的重要因素，產量的重要因素，生物量的下降勢必會造成生物量的下降勢必會造成-PGA的產量的降低。的產量的降低。鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用2. 2. 鈣離子對鈣離子對-PGA-PGA產量的影響產量的影響圖4-2 不同CaCl2濃度組中-PGA的產量02468101200.050.10.150.2-PGA yield g/LCaCl2 concentration /結 果 ：結 果 ： 當 發 酵 液 中當 發 酵 液

40、 中Ca2+濃度逐漸升高時，濃度逐漸升高時，-PGA產量呈先升高后降低產量呈先升高后降低的趨勢。當的趨勢。當CaCl2濃度為濃度為0.1時，時，-PGA產量可達產量可達最大為最大為9.68g/L 。分析：分析： -PGA產量的產量的變化是變化是Ca2+對對GDH活性活性的調控與對發酵生物量的的調控與對發酵生物量的影響兩者共同作用的結果。影響兩者共同作用的結果。鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用3. 3. 鈣離子對發酵液中鈣離子對發酵液中NHNH4 4ClCl消耗量的影響消耗量的影響圖4-3 不同CaCl2濃度組中NH4Cl的消耗量00.20.40.60.8100.050.10.150

41、.2NH4Cl consumption g/L CaCl2 concentration /結 果 ：結 果 ： 當 發 酵 液 中當 發 酵 液 中Ca2+濃度升高時，濃度升高時，NH4Cl的消耗量呈先升高后降低的消耗量呈先升高后降低的趨勢。當的趨勢。當CaCl2濃度為濃度為0.1時，時，NH4Cl的消耗量的消耗量可達最大可達最大0.766g/L 。分析：分析：該結果該結果-PGA產量變化結果相一致。產量變化結果相一致。鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4. 4. 鈣離子對鈣離子對-PGA-PGA產量調控的可能原因分產量調控的可能原因分析析Ca2+增加胞內增加胞內GDH表表達量達量菌

42、體生長菌體生長繁殖具有繁殖具有抑制作用抑制作用CaCl20.1時，時，-PGA產量隨產量隨Ca2+濃度升高而減小。濃度升高而減小。 CaCa2+2+濃度繼續增大，雖濃度繼續增大，雖GDHGDH在胞內的合成量繼續增加，但在胞內的合成量繼續增加，但發酵發酵菌體數量菌體數量迅速減少，導致迅速減少，導致GDHGDH總活性反而降低了，底物總活性反而降低了，底物NHNH4 4ClCl的消耗量減少，催的消耗量減少，催化合成化合成GluGlu的量相應降低，的量相應降低，導致導致-PGA-PGA的合成量的合成量降低降低，產量下降，產量下降。鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用小結與討論小結與討論（1）實

43、驗表明在發酵過程中）實驗表明在發酵過程中Ca2+對菌體的生長繁殖具有一定的抑對菌體的生長繁殖具有一定的抑制作用。制作用。（2）實驗表明在發酵過程中）實驗表明在發酵過程中Ca2+對對-PGA產量及底物產量及底物NH4Cl消耗消耗量具有影響作用。量具有影響作用。CaCl2濃度為濃度為0.1時，時，-PGA產量可達最大產量可達最大9.68g/L，底物，底物NH4Cl消耗量同樣為最大消耗量同樣為最大0.766g/L。（3）本研究分析了）本研究分析了Ca2+對對-PGA產量調控的可能原因，以期為產量調控的可能原因，以期為Ca2+調控調控-PGA發酵提供理論依據。發酵提供理論依據。匯報內容匯報內容研究背景

44、與意義研究背景與意義1谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究谷氨酸脫氫酶鈣調節機制研究3谷氨酸脫氫酶基因的驗證谷氨酸脫氫酶基因的驗證2鈣離子對發酵的調控作用鈣離子對發酵的調控作用4結論與展望結論與展望5結論與展望結論與展望結論結論本文以納豆芽孢桿菌本文以納豆芽孢桿菌HSF 1410為實驗材料，研究了為實驗材料，研究了GDH的的Ca2+調控機制以及調控機制以及Ca2+對發酵的調控影響，得出的結論如下：對發酵的調控影響，得出的結論如下：（1）獲得）獲得gdhA谷氨酸脫氫酶基因，序列比對得知谷氨酸脫氫酶基因，序列比對得知gdhA與與NCBI上上已報道的已報道的B. subtilis natto gudB谷氨酸脫

45、氫酶基因序列具有谷氨酸脫氫酶基因序列具有100%同源同源性；構建重組表達質粒性；構建重組表達質粒pET28a/gdhA，于大腸桿菌，于大腸桿菌BL 21中成功進行中成功進行體外表達，所獲目的蛋白與預測的體外表達，所獲目的蛋白與預測的gdhA編碼蛋白分子量一致，確證編碼蛋白分子量一致，確證gdhA確為谷氨酸脫氫酶基因。確為谷氨酸脫氫酶基因。（2）明確了）明確了GDH的的Ca2+調節機制。調節機制。Ca2+對對GDH無體外直接激活無體外直接激活作用，而是在發酵過程中進入胞內，通過調控作用，而是在發酵過程中進入胞內，通過調控gdhA的的mRNA轉錄水轉錄水平，增加了平，增加了GDH在菌體中的表達量在菌體中的表達量，從而使細胞內，從而使細胞內GDH活性升高。活性升高。結論與展望結論與展望（