1、·論著·神經行為與不同鉛暴露水平新生兒臍血中腦源性神經生長因子含量的相關性研究任麗華穆秀英陳紅艷楊紅麗祁葳【摘要】目的探討鉛暴露新生兒臍血中腦源性神經生長因子(BDNF與新生兒神經行為評分(NBNA之間的相關性。方法采用單純隨機法選擇20112012年于太原市某醫院足月順產的新生兒,采集新生兒臍血,納入臍血鉛含量0.48mol/L的男、女嬰各30名,作為高鉛暴露組,共60名;將臍血鉛含量<0.48mol的新生兒納入低鉛暴露組,并按照性別構成、孕周、體重、身長和頭圍與高鉛暴露組進行配對,最終納入60名。采用石墨爐原子吸收分光光度法檢測血鉛水平,新生兒20項神經行為檢查法

2、檢查新生兒神經行為發育狀況,ELISA法檢測臍血血漿中腦源性神經生長因子的含量。比較兩組新生兒臍血BDNF含量以及NBNA得分,并將血鉛水平與BDNF、BDNF與新生兒NBNA得分進行直線相關性分析。結果高鉛暴露組臍血鉛含量為(0.613±0.139mol/L,高于低鉛暴露組臍血鉛含量的(0.336±0.142mol/L(t=3.21,P<0.001。高鉛暴露組新生兒NBNA總分(36.35±1.86分、主動肌張力得分(6.90±0.27分和一般評估得分(5.93±0.32分低于低鉛暴露組分別為(38.13±0.96分、(7.7

3、9±0.35分、(6.00±0.00分,t值分別為8.21、10.23、2.32,P值分別為<0.001、<0.001、0.037。高鉛組新生兒臍血中BDNF含量(3.538±1.203ng/ml高于低鉛組(2.464±0.918ng/ml(t=7.60,P<0.001。相關性分析發現,臍血中BDNF含量與神經行為總分、被動肌張力、主動肌張力得分均呈負相關(r值分別為-0.27、-0.29、-0.30,P值均<0.001。結論臍血鉛暴露可引起新生兒神經行為損害,引起臍血BDNF含量增加,可能可以作為鉛引起新生兒神經行為損害的生物標

4、志物。【關鍵詞】鉛中毒,神經系統;腦源性神經營養因子;神經行為測試;臍血Prenatal lead exposure related to cord blood brain derived neurotrophic factor(BDNFlevels andimpaired neonatal neurobehavioral development Ren Lihua,Mu Xiuying,Chen Hongyan,YangHongli,Qi Wei.Department of Prevention and Health Care,Shanxi People's Hospital,Tai

5、yuan030012,ChinaCorresponding author:Ren Lihua,Email:rlh1205【Abstract】Objective To explore the relationship between umbilical cord blood brain-derived neurotrophic factor(BDNFand neonatal neurobehavioral development in lead exposure infants.Methods All infants and their mother were randomly selected

6、 during2011to2012,subjects wereselected according to the umbilical cord blood lead concentrations,which contcentration of lead was higherthan0.48mol/L were taken into high lead exposure group,about60subjects included.Comparing to thehigh lead exposure group,according to gender,weight,pregnant week,l

7、ength and head circumferenece,thelevel of cord blood lead concentration under0.48mol/L were taken into control group,60cases included.Lead content was determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry.Neonatal behavioral neurological assessment(NBNAwas used to determine the development o

8、f neonatal neuronal behavior.The content of BDNF was detected by ELISA.Comparing the BDNF and the NBNA score between twogroups,and linear correlation was given on analysis the correlation between lead concentration in cordblood and BDNF,BDNF and the NBNA score.Results Lead content in high exposure g

9、roup was(0.613±0.139mol/L,and higher than(0.336±0.142mol/L in low exposure group(t=3.21,P<0.001.NBNAsummary score(36.35±1.86,active muscle tension score(6.90±0.27and general assessment score(5.93±0.32in high exposure group were lower than those(38.13±0.96,7.79±0

10、.35,6.00±0.00in low exposuregroup(t values were8.21,10.23,2.32,respectively,P values were<0.001,<0.001and0.037.BDNFcontent in high exposure group which was(3.538±1.203ng/ml was higher than low exposure group(2.464±0.918ng/ml(t=7.60,P<0.001.The correlation analysis found that

11、the cord blood BDNF content wasDOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.06.008作者單位:030012太原,山西省人民醫院預防保健處通信作者:任麗華,Email:rlh1205negatively correlated with NBNA summary score,passive muscle tension and active muscle tone score(r was-0.27,-0.29,-0.30,respectively,P values were<0.001,respectively.Conclus

12、ion Prenatal lead exposure results poor neonatal neurobehavioral development and cord blood BDNF was negatively correlated with neonatal neurodevelopment,may serve as a useful biomarker.【Key words】Lead poisoning,nervous system;Brain-derived neurotrophic factor;Neonatal behavioral neurological assess

13、ment;Cord blood鉛是一種對人體危害極大的有害重金屬,廣泛存在于環境與職業暴露中,可對機體多個系統、器官產生損傷作用,同時,鉛對神經系統具有強的親和性1,易對神經系統造成損害。鉛可通過單純擴散或者與鈣競爭鈣離子通道經胎盤屏障而進入胎兒循環系統,導致未發育成熟大腦的血腦屏障通透性增強,通過腦內皮細胞的胞飲作用攝入大量的鉛2。胎兒期是人類神經系統生長發育最為迅速的階段,有研究表明,鉛暴露對胎兒及兒童神經系統的影響沒有最低閾值,即使極低水平的鉛暴露也會導致兒童神經行為方面的缺陷3。腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF在腦組織中高

14、度集中分布,不僅能促進神經干細胞的增殖和分化,還能維持正常神經元的功能,并對損傷的神經元進行修復。腦組織中的BDNF可以通過血腦屏障進入血液4-12。但是該結論尚且缺乏足夠的證據支持,因此,在本研究中,通過人群研究對太原市某醫院的鉛暴露的孕婦臍血中BDNF含量與新生兒20項神經行為評分(neonatal behavioralneurological assessment,NBNA之間的關系進行研究,以期為鉛暴露水平對新生兒神經損傷提供依據。對象和方法1.對象:采用單純隨機法隨機選擇20112012年于太原市某醫院足月順產的新生兒,測量新生兒臍血血漿鉛含量,納入臍血鉛含量0.48mol/L的男、

15、女嬰各30名為高鉛暴露組13,共60名;同一時期,將臍血鉛含量<0.48mol的新生兒納入低鉛暴露組,并按照性別構成、孕周、體重、身長和頭圍與高鉛暴露組進行配對,最終納入新生兒60名。排除早產、難產的新生兒,有嚴重黃疸的新生兒,有新生兒窒息癥狀、腦膜炎及腦外傷等影響智力的疾病以及其他嚴重的全身性、肝、腎性及代謝性疾病的新生兒。并在孕婦分娩當日采集孕婦靜脈血。本研究獲得山西省人民醫院倫理委員會批準(批號: 2014省醫倫審5號。所有研究對象及其監護人簽署知情同意書后,進行生物樣本的采集和測試。2.試劑及儀器:BDNF ELISA試劑盒、ABC工作液、TBC顯色液(武漢博士德生物工程有限公司

16、,酶標儀(美國Becton-Dickin-Son公司, CEM-MARS5微波消解儀(美國CEM公司,石墨爐原子吸收光譜儀(美國Thermo elemental公司。3.實驗方法:(1血鉛含量的測定:在孕婦分娩時采集孕婦靜脈血和新生兒臍血各5ml,肝素抗凝管之后于-20保存。測定時取200l血樣,加入0.1mol/L的稀硝酸3ml,混勻后放置過夜,加入體積分數為0.1的三氯醋酸300l,900×g離心15min,取上清液于石墨爐原子吸收法測定血鉛含量。采用國家全血標準物質進行標準曲線繪制,實驗精密度相對標準偏差小于5%,加標回收率大于90%5。(2新生兒神經行為發育評價:本研究中采用

17、我國鮑秀蘭4修訂的新生兒20項神經行為檢測法,對出生后3d以內的新生兒的頭圍、體重、身長以及神經行為進行評價,其中包括對外界環境和外界刺激的適應性、被動肌張力、主動肌張力、原始反射和一般反應5個方面。根據反應程度的不同,分為0、1和2分3個等級,以總分>35分為合格。(3臍血血漿中BDNF含量的測定:將采集到的臍血轉移至5ml離心管中,900×g離心15min,采用吸管將分離出來的血漿轉移至離心管中于-80低溫冰箱保存。按照BDNF Elisa試劑盒說明制備好標準品各濃度稀釋液。將待測血漿適當倍數稀釋后加入包被有BDNF抗體的酶標中,37反應90min后去除液體。每孔加入生物素

18、抗人BDNF抗體工作液100l, 37反應60min。PBS洗滌三次。每孔加入ABC 工作液100l,37反應30min。PBS洗滌5次。每孔加入90l已在37平衡30min的TMB顯色液,37避光反應20min。每孔加入100l TMB 終止液。除去孔內氣泡,用酶標儀在450nm讀取每孔吸光度值(A值,根據標準品A值繪制曲線,根據樣品稀釋倍數求得待測血漿樣本中BDNF 含量。4.統計學方法:數據錄入采用Epidata3.0軟件,應用SPSS13.0統計軟件進行分析,兩組孕婦年齡、體重、靜脈血鉛含量以及新生兒體重、身長、頭圍、臍血中的鉛含量、BDNF含量以及新生兒NBNA 得分符合正態分布,以

19、x±s表示,采用t檢驗進行分析。對血鉛與BDNF、BDNF與新生兒NBNA得分進行直線相關性分析,以P<0.05為差異有統計學意義。結果1.高、低鉛暴露組孕婦及新生兒一般情況:由表1可見,兩組孕婦的年齡、體重差異沒有統計學意義。兩組新生兒的體重、身長、頭圍差異也沒有統計學意義。2.不同臍血鉛暴露組血鉛結果:兩組孕婦靜脈血及新生兒臍血血鉛的含量見表2。高鉛組與低鉛組血鉛含量的差異有統計學差異。進行相關分析后發現,孕婦靜脈血與新生兒臍血血鉛含量相關性較高(r=0.77,P<0.001。3.新生兒神經行為得分比較:在對兩組新生兒進行20項神經行為檢測發現,低鉛暴露組60名新生兒

20、中無不達標新生兒;而高鉛暴露組中有1個未達正常標準(35分。具體各項指標的比較見表3。在對兩組新生兒的20項神經行為檢查中,高鉛暴露組新生兒的總分高于低鉛組,且兩組新生兒在NBNA總分、主動肌張力、一般評估得分之間的差異均有統計學意義(P<0.05。4.臍血BDNF含量比較:高鉛組新生兒臍血中BDNF含量為(3.538±1.203ng/ml,高于低鉛組的(2.464±0.918ng/ml,兩組BDNF含量差異有統計學意義(t=7.60,P<0.001。進而對臍血鉛濃度和臍血BDNF水平進行分析,得到r=0.286,P<0.001,存在直線相關關系,隨著臍血

21、鉛濃度增加,BDNF水平有增高趨勢。5.臍血中BDNF含量與新生兒神經行為得分的相關性分析:通過對臍血中BDNF含量與新生兒神經行為得分進行相關性分析發現,新生兒臍血中BDNF含量與NBNA總分、被動肌張力,主動肌張力和一般評估得分均呈負相關,見表4。且與主動肌張力得分的相關性>與被動肌張力得分的相關性>與NBNA總分的相關性>與一般評估得分的相關性。進一步對高鉛暴露組臍血中BDNF含量與新生兒神經行為指標進行了相關分析,結果表明:高鉛暴露組新生兒臍血中BDNF含量與神經行為總分、被動肌張力、主動肌張力和一般評估得分也呈負相關,見表5。表2兩組新生兒臍血鉛及孕婦靜脈血含量比較

22、(mol/L,x±s組別低鉛暴露組高鉛暴露組t值P值人數6060新生兒臍血0.336±0.1420.613±0.1393.21<0.001孕婦靜脈血0.401±0.2930.622±0.3612.18<0.001討論鉛是一種可以對發育期神經系統產生損傷的神經毒物,可對中樞神經系統多個神經化學通路、血腦屏障、突觸、髓鞘和兒茶酚胺代謝造成損傷,又因胎兒和兒童期神經系統相對不發達,環境中的鉛暴露可對其認知功能造成嚴重影響。有研究表明血鉛水平每上升0.1g/L,學齡期兒童的智商會下降0.91分7,并且已有不少研究證實了孕期鉛暴露與新生兒神經

23、行為發育之間的關系8-9。胎兒體內的鉛主要是通過母體與胎體之間的胎盤轉運而來,有研究發現,鉛經胎盤轉運最早可在妊娠第12周發生,此后胎兒體內的鉛負荷呈增長趨勢10。在本研究中,研究者通過對母體靜脈血和新生兒臍血之間的研究發現它們存在高度的相關,且臍血血鉛含量約為母體血鉛含量的80%,也間接證明了母體和胎兒之間存在鉛轉運。由于出生前后的胎兒本身的發育特點,其血腦屏障發育尚不完善,使其對外源性化學毒物特別敏感,而鉛又易于通過血腦屏障而沉積在腦中,影響正常的腦發育和腦功能。因此可以認為沒有一個絕對安全的鉛暴露范圍。本研究發現,鉛暴露可對表1兩組孕婦及新生兒一般情況比較(x±s組別低鉛暴露組

24、高鉛暴露組t值P值人數6060孕婦年齡(歲27.72±5.9428.10±3.970.420.733孕婦生產時體重(kg71.97±9.1773.26±9.730.740.640新生兒體重(kg3.53±0.373.40±0.401.890.058新生兒身長(cm48.68±2.2447.93±2.101.880.080新生兒頭圍(cm34.77±1.2034.48±1.501.160.203表4兩組新生兒臍血BDNF 含量與NBNA 得分相關性分析項目NBNA 總分行為能力被動肌張力主動肌張力

25、原始反射一般評估r 值-0.27-0.09-0.29-0.30-0.06-0.18P 值<0.0010.172<0.001<0.0010.2680.038注:NBNA:新生兒神經行為評估;BDNF :腦源性生長因子表5高鉛暴露組新生兒臍血BDNF 含量與NBNA 得分相關性分析項目NBNA 總分行為能力被動肌張力主動肌張力原始反射一般評估r 值-0.39-0.10-0.37-0.30-0.10-0.20P 值<0.0010.076<0.001<0.0010.2580.046注:NBNA:新生兒神經行為評估;BDNF :腦源性生長因子新生兒神經發育行為產生損傷

26、,這與以往研究結果一致11-12。有研究發現,臍血鉛含量低于0.32mol/L時,新生兒已能表現出一定的神經發育損傷效應12。而本研究采用0.48mol/L 作為劃分低鉛和高鉛暴露組的界限,是因為有研究表明以此水平為界兩組在新生兒NBNA 方面的差異有統計學意義14。BDNF 主要在中樞神經系統中表達,廣泛分布于海馬、皮質和杏仁核等部位,BDNF 可以通過靶源性、自分泌、旁分泌方式與神經細胞上高親和力受體p75結合,激發各種信號傳導通路而發揮其特殊的生物作用14。不僅能促進神經干細胞的增殖遷移,還能促進突觸的可塑性,參與學習的可塑性和長時程增強效應,對學習記憶功能起重要作用15-16。目前大多

27、數研究顯示鉛通過抑制發育中腦BDNF 的轉錄、翻譯和轉運17-18,降低實驗動物的學習能力,也有學者發現鉛可增加大鼠腦中BDNF 的表達19-20,拮抗鉛的毒性作用。目前尚未見鉛對臍血血漿BDNF 影響的報道,有研究表明胎盤有BDNF 及其受體表達21,胎盤與胎兒神經發育關系密切,本研究發現高鉛暴露組新生兒臍血血漿BDNF 含量明顯高于低鉛暴露組,這可能與高鉛組胎盤或者新生兒神經系統在胚胎發育時受到鉛的毒性損傷,BDNF 應激性升高而提供一定保護作用22。本次研究發現BDNF 與新生兒神經行為評價中的3項有相關性,而且和NBNA 總分也有相關性,說明隨著新生兒臍血中BDNF 含量的增高,NBN

28、A 評分下降。臍血BDNF 可以作為新生兒神經發育損害的標志物。以上研究結果表明,孕期鉛暴露會對新生兒神經行為能力產生不良影響,胎兒臍血中BDNF 含量明顯增高,與神經行為呈負相關,可能作為新生兒神經發育損害的標志物。但是由于BDNF 本身的復雜性以及本次研究尚無法說明BDNF 含量與新生兒神經行為能力下降程度之間的關系,因此臍血BDNF 在鉛所致新生兒神經發育中的作用有待于進一步探討。參考文獻1Mason LH,Harp JP,Han DY.Pb neurotoxicity:neuropsychological effects of lead toxicityJ.Biomed Res Int

29、,2014,2014:840547.DOI:10.1155/2014/840547.2Lin CM,Doyle P,Wang D,et al.The role of essential metals in the placental transfer of lead from mother to childJ.Reprod Toxical.2009,29:443-446.DOI:10.1016/j.reprotox.2010.03.004.3Dapul H,Laraque D.Lead poisoning in childrenJ.Adv Pediatr,2014,61(1:313-333.D

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32、:10.1080/10934520903139829.表3兩組新生兒NBNA 得分比較(x ±s 組別低鉛暴露組高鉛暴露組t 值P 值人數6060NBNA 總分38.13±0.9636.35±1.868.21<0.001行為能力11.35±0.6211.18±0.711.820.078被動肌張力7.86±0.237.63±0.291.710.081主動肌張力7.79±0.356.90±0.2710.23<0.001原始反射5.82±0.545.83±0.620.810.47

33、1一般評估6.00±0.005.93±0.322.320.037注:NBNA:新生兒神經行為評估8Hu H,Téllez-Rojo MM,Bellinger D,et al.Fetal lead exposureat each stage of pregnancy as a predictor of infant mentaldevelopmentJ.Environ Health Perspect,2006,114(11:1730-1735.9潘麗明,黃慶生,許勇.子宮內低鉛暴露對嬰兒早期神經行為影響的研究J.廣東微量元素科學,2009,16(4:41-44.DO

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