1、血吸蟲抗體快速檢測試劑盒的綜述資料1、 產品預期用途1.1產品預期用途：血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點免疫金滲濾法）簡稱試劑盒，是用于體外定性人血清中是否有血吸蟲抗體，是用于診斷血吸蟲病的依據，也是血吸蟲病預防控制的基礎、流行病學調查的工具、疫情監測的手段。1.2與預期用途有關的臨床適應癥背景情況：血吸蟲病免疫學診斷方法是十分可靠的輔助診斷依據，也是流行病學調查最常用的工具。1.3相關的臨床或實驗室診斷方法及產品現狀等：血吸蟲病是一種嚴重威脅人類健康的流行性傳染病，發展有效的診斷篩查方法能促進血吸蟲病流行的預防控制工作。國內外已建立用于血吸蟲病診斷的病原學、免疫學及分子生物學等多種方法，病原學

2、診斷方法（糞便查蟲卵）由于敏感性較低，分子生物學方法（如PCR）需要特殊的儀器設備，均難以在流行區現場推廣。目前，常用的血吸蟲病現場篩查方法仍以免疫學方法為主，如酶聯免疫吸附法（ELISA）、環卵沉淀（COPT）、間接血凝（IHA）。 隨著現代免疫理論和技術的進步，免疫學檢測技術得到了不斷發展和更新，快速簡便，易于操作的免疫學診斷方法更易于被醫技人員，尤其是現場防治人及患者所接受。上海疾控生物科技有限公司生產的“血吸蟲抗體快速檢測試劑盒”操作簡便，不需要使用儀器設備，結果易于判讀，適合于各級醫療衛生機構及現場血吸蟲病防治人員使用。此方法納入了中華人民共和國衛生行業標準 血吸蟲病診斷標準（WS2

3、61-2006）目前國內外尚無類似產品。2、產品描述2.1 產品所采用的技術原理：氯金酸(HauCI )在還原劑的作用下可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液稱膠體金。膠體金顆粒表面帶有負電荷與蛋白質等生物大分子的正電荷基團因靜電作用形成牢固結合，而蛋白質的生物活性無明顯的改變。當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點。2.1.1血吸蟲抗體試劑盒測定原理：斑點免疫金滲濾法（Development of dot immunogold filtration assay，DIGFA)是以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的可濾過性和毛細管作用，使抗原抗體反應在一個特殊的滲

4、濾裝置上，以液體滲濾過膜的方式迅速完成。滲濾裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，在盒蓋中央的小孔下面放置了一片硝酸纖維素膜，膜上預包被血吸蟲抗原斑點，試驗時將血清滴加在膜上，通過滲濾使抗原抗體在膜上發生免疫結合反應，然后滴加金標結合物，使其與對應的抗體結合并顯色，陽性結果在膜上出現紅色斑點，反之，則為陰性結果。斑點顏色的深淺相應地提示陽性強度。2.1.2試劑盒產品的組成：試劑盒是由檢測盒、洗滌液、顯色液組成。檢測盒為ABS 材料制成的一個白色帶孔塑料盒，塑料盒孔內的濾膜上包被有點狀可溶性血吸蟲抗原的檢測點及人IgG的質控點。 洗滌液由TBS、吐溫20組成。顯色液由氯金酸、鞣酸-檸檬酸鈉、羊抗人Ig

5、G組成。2.1.3測定主要參數試驗方法：將試劑盒取出，置于室溫下回暖，編號；在檢測盒中央小孔內滴加2滴洗滌液，滲入后于反應板中央加25 l 受檢血清，待液體充分吸入，加2滴洗滌液，滲入后加4滴顯色液，最后加2滴洗滌液，滲入后即可判斷結果。出現兩個紅色斑點為陽性，出現一個紅色斑點為陰性，無斑點表示結果無效。（洗滌液與顯色液每滴約為40ul）2.2 主要原材料來源及制備方法2.2.1 產品的組成 洗滌液 TBS、吐溫20 顯色液 氯金酸、鞣酸-檸檬酸鈉、羊抗人IgG 檢測點試液 0.2 mg/ml 質控點試液 0.01mol2.2.2主要原料的規格來源 洗滌液 外購 顯色液 外購 【由上海市疾病預

6、防控制中心提供】 檢測點原料 外購 【由上海市疾病預防控制中心提供】 檢測點試液 自制 質控點試液 自制 塑料盒 定制 吸水紙 符合GB/T 20808-2006 外購 【國產】 硝酸纖維素膜 外購 【進口】2.2.3主要原料的制備方法2.2.3.1血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）（試劑盒檢測點原料）（1）制備方法：取人工感染1500條日本血吸蟲尾蚴45d的家兔肝臟，用生理鹽水洗凈后經高速搗碎機搗碎，分樣篩分離除去肝臟組織，沉淀離心，收集分離蟲卵，依次經200目和300 目尼龍絹過濾，收集濾渣，即為較純凈的血吸蟲蟲卵。然后加入10倍量的生理鹽水，置玻璃勻漿器內制成勻漿，用超聲粉碎機超聲處理（1m

7、in10次），液氮凍融3次，最后以10 000 r/ min 離心30 min ，上清液即為血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA），經0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，20凍存備用。（2）工作濃度：SEA 的作用是作為檢測點，包被于硝酸纖維素膜上，用于檢測人血清中特異性抗血吸蟲抗體。因此，其工作濃度的選擇對于檢測效果的評價是試劑盒研制的關鍵技術。如果濃度過高，陽性反應色度過強，易產生假陽性結果；反之，濃度過低，則不易辨別，影響檢測的靈敏度2.2.3.2金標二抗（試劑盒顯色液原料）（1）制備方法：a. 膠體金制備采用鞣酸-檸檬酸鈉還原法，膠體金顆粒直徑為20 nm。具體方法為：取1%氯金酸5ml溶于39

8、5 ml dH2O，加熱至60 ，快速加入鞣酸-檸檬酸鈉溶液100 ml（1%檸檬酸三鈉20 ml，1%鞣酸0.05 ml，dH2O 80 ml），加熱煮沸15 min，溶液顏色由黑逐漸變為亮紅色。冷卻后用0.1 mol/L碳酸鉀調溶液pH至8.0。金標二抗制備二抗為親和層析法純化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白濃度為3.34mg/ml，批號：IP2030)。最適蛋白穩定量選擇：將待標記的二抗分別加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質的對照管，分鐘后加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置小時觀察結果，紅色不變者為能使膠體金穩定的蛋白量，再加20即為最適標記蛋白量。2.

9、2.2.3 人IgG（試劑盒質控點原料）（1）制備方法：采用辛酸提純法從健康獻血者血清中提取人IgG。經0.22um超濾膜過濾除菌后分裝，2ul/支，置凍干機抽成干粉，-20保存。臨用時每支加工作濃度的PBS復溶即可。（2）工作濃度：人IgG的作用是作為質控點，包被于硝酸纖維素膜上，能夠與金標二抗結合，產生紅色圓點，以此判斷金標二抗處于有效期內；如不能出現紅色圓點，則金標二抗失效。因此，試驗目的就是選擇能清晰產生反應色度的人IgG濃度。2.2.2.4說明上述原料均系上海市疾病預防控制中心作為本產品技術成果轉化的配套提供給本公司。2.3 主要生產工藝過程2.3.1 試液（顯色液、洗滌液）分裝：準

10、備分裝清場確認2.3.2試劑盒： 準備吸水紙折疊塑料盒組裝試劑溶液（檢測點試液、質控點試液）配制檢測點質控點包被內包裝清場確認2.3.3 外包裝： 準備試液、試劑盒、標簽質量判定外包裝清場確認2.3.4 產品生產的工藝環境控制 為保證試劑盒產品的穩定，本公司按試劑生產管理相關法規規定，對產品生產過程的環境實施了凈化（10萬級）控制措施，并建立實現了產品實現的追溯管理，以保證產品的使用性能，在符合產品標準規定的同時，滿足臨床檢測篩選診斷的精度要求。2.4 質控品的制備方法及溯源情況 本公司的質控品用途是對產品出廠前的性能檢測，由上海市疾病預防控制中心在提供檢測點試液時配套提供，進廠入庫前均由上海

11、市疾病預防控制中心出具檢驗報告。本質控品是參照“血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品” （中國藥品生物制品檢定所 批號：20041108）低感染度抗體水平(P13)制備，作為斑點免疫金滲濾法血吸蟲抗體陽性臨界值參照。3、生物安全性及廢品處理血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點免疫金滲濾法）主要成分是血吸蟲蟲卵抗原及人IgG，是生物活性蛋白，在生物活性傳染性物質名錄中，血吸蟲抗原和人IgG沒有被列入其中。同時，經過上海市疾病預防控制中心多年的實踐經驗，均無生物污染及危害性。一旦不慎濺入眼睛，可立即用水沖洗。試劑用塑料瓶裝外用紙盒打箱，基本無泄漏，運輸中不會污染環境，塑料瓶和紙箱由醫院按醫療垃圾處理。醫院在檢

12、驗過程中使用的血清標本，則按醫院管理的相關制度執行滅活處理。4、產品主要研究結果的總結和評價4.1 主要研究結果的總結 膠體金斑點免疫滲濾法是上世紀90年代以來我國血吸蟲病免疫診斷上新出現的方法，其優勢在于操作簡便、反應快速，不需任何專門設備，不需工作人員特殊培訓，既可用于大規模血清流行病學調查，又能作為單份檢測個別病例的免疫學診斷工具。經中國科學院上海科技查新咨詢中心評價，綜合技術在國內處于領先，并達到國際先進水平。因此本公司在 2008 年引進了由上海疾控中心的研制成果，膠體金斑點免疫滲濾法的血吸蟲抗體快速檢驗試劑盒的生產技術，并經產業化轉換，已實現產品生產工藝的完備，產品的定型標準化以及

13、臨床適用性的驗證工作。使之成為具有臨床實際使用意義的醫療器械篩選類試劑。4.2 對試劑盒的評價4.2.1 性能分析評價根據最佳條件組成的試劑盒對血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品的測試結果，顯示出陰、陽性參考品的檢測符合率均高于90 %，靈敏度為1:4，精密度測試10次均為陽性，顯色均勻一致，均符合國家參考品的檢測質量要求（表1）。表1 血吸蟲病抗體診斷試劑國家參考品的測試結果Table1. Results of detecting the national reference IgG serum of schistosomiasis by dot immunogold filtration as

14、say（DIGFA）kit.血清Sera份數No. sera 陰性(數)No. negative陽性(數)No. positive符合率（%）Coincident rates陰性參考品Negative reference sera15150100陽性參考品Positive reference sera15015100靈敏度參考品Detectable minimum reference sera4(1:21:16)2（1:8；1:16）2 (1:2；1:4)1:4精密度參考品Precision reference sera10010100血吸蟲病抗體強度依次為、+、+、+The intensit

15、y of antibody to schistosomiasis is 、+、+、+, respectively.圖1 金標滲濾法檢測血吸蟲病抗體強度效果圖 Fig.1 Results of detecting the intensity of antibody to schistosomiasis by dot immunogold filtration assay（DIGFA）4.2.2穩定性：試劑盒在穩定性及加速破壞性實驗中，對15份陽性參考血清和15份陰性參考血清及靈敏度、精密度檢測血清的檢測結果表明：從加速破壞性實驗來看，試劑盒在37保存5天后，陽性檢出率和陰性檢出率可保持不變，靈敏

16、度高于1：4，精密度好；4條件下保存180天后，陽性檢出率和陰性檢出率保持不變，靈敏度高于1：4，精密性好。且兩者陽性反應的強度均未見減弱。4.2.3現場效果測評4.2.3.1 設計方案：根據臨床研究方案要求，本臨床試驗以2種糞檢（Kato-Katz法和毛蚴孵化法）結果作為血吸蟲病陽性診斷金標準，以無血吸蟲感染史、無血吸蟲疫水接觸史且糞檢結果陰性作為血吸蟲陰性診斷金標準，在流行區篩選血吸蟲病患者（金標準陽性）和非流行區選擇陰性對照者（金標準陰性）作為臨床試驗對象。試驗對象總數不少于1000例，按要求采集試驗對象的血清樣本。在各實驗室將所有血清樣本（陽性和陰性）次序混和后重新隨機排列、分別將血清

17、吸入新編次序的血清管中制備成血清盤，由統計人員管理原始編號和新編號信息。由經過培訓的操作人員用血吸蟲抗體快速檢測試劑盒對血清盤進行檢測和結果判斷，整個試驗中對臨床試驗的操作人員和結果判斷者實行雙盲，試驗結束后由統計人員將檢測結果與金標準判定結果進行比較分析，計算血吸蟲抗體快速檢測試劑盒的陽性符合率（敏感性）和陰性符合率（特異性）等指標。4.2.3.2 現場測評結果本次臨床實驗共收集1132份血清，采用上海疾控生物科技有限公司的試劑盒與金標準進行同步盲法檢測；運用靈敏度、特異度、調整一致性、約登指數這幾個指標對該診斷試劑進行評價。 檢驗結果見下表:診斷試劑 敏感度 特異度 調整一致性 約登指數

18、試劑盒 94.2% 97.2% 93.7% 0.912 從上述表中可以看出，試劑盒靈敏度較高，與病原學陽性的血清檢測結果基本一致。 采用調整一致性、約登指數進行分析，說明試劑盒檢測結果與金標準檢測結果之間具有較好的真實性，對判斷陽性和陰性結果具有較強的準確性。能夠準確鑒別具有患病人群和正常人群能力。4.3 結論：上海疾控生物科技有限公司生產的血吸蟲抗體快速檢測試劑盒（斑點免疫金滲濾法）。具有以下特點1. 快速：全部檢測過程僅需1-2分鐘。2. 簡便：不需其它任何儀器設備，操作也極其簡單，可隨時隨地進行。3. 可單份檢測：對標本既能成批檢測，又可單份檢測，患者可立刻拿到結果，不必等待。4. 高敏感性和特異性該試劑盒不存在放射性危害可以在臨床檢驗及疫區血防所進行大規模篩查使用，為日本血吸蟲病的診斷和治療提供有效的依據。5、其他本產品是上海市疾病預防控制中心寄生蟲病研究室多年研究的成果，作為技術成果轉化的產物，由上海疾控生物科技有限公司按體外診斷