1、Western Blot操作步驟1、細胞總蛋白的提取用胰酶-EDTA將貼壁生長的細胞消化，用PBS溶液洗3次，棄去PBS溶液后，加入適量體積的蛋白提取液（1ml預冷的Lysis Buffer加入5l磷酸酶抑制劑1l蛋白酶抑制劑和5l 100Mm PMSF，三種試劑均放在制冷盒中）后，旋渦振蕩器混勻，冰浴振蕩15min（將搖床放在冰箱中）。于4，12000rpm離心20min，收集上清液，分裝于Ep管中（一般每管100ul），-80保存（保存時間短-20即可）?？扇∩倭康鞍子糜诘鞍锥浚ㄗ霰容^時一定得定量：考馬斯亮藍染色酶標儀595nm測光密度）。2、配制12%分離膠（總體積為7ml）配置前先將

2、膠板洗凈（肥皂水洗-雙蒸水沖-無水乙醇沖），晾干后用封口膜封好底部及側(cè)面（如有凡士林可先涂之再封更保險），放在支架上夾好。取三蒸水2340ul，30%丙烯酰胺2800ul，分離膠buffer 1750ul（小分子量蛋白用15%分離膠：分別為三蒸水1680ul；30%丙烯酰胺3500ul；分離膠buffer 1750ul），SDS 60l，TEMED（四甲基乙二胺，避光保存） 6l，10%過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配或4避光保存不超過兩周）30l。混勻后，倒入放置好的膠板中。在液面上加一層無水正丁醇，使液面平整。待膠完全凝固后，倒掉正丁醇，用三蒸水沖洗幾次，其余液體用濾紙吸凈。3、配制5%濃縮膠（總體積為

3、2ml）取三蒸水1100ul，30%丙烯酰胺333l，濃縮膠buffer 500ul，SDS 20l，TEMED 4l，10%過硫酸銨20l，混勻后，加在分離膠的上層，插入梳子（注意不要有氣泡），待膠凝固。4、處理蛋白樣品自冰箱中拿出蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液（蛋白樣品與緩沖液總量為30ul：6ul/24ul，如果蛋白量體積夠的話，總體積40ul，marker用20ul），將小管蓋好蓋后用封口膜封好以防止煮沸過程中開蓋導致稀釋，插在專用有孔泡沫上，在沸水中煮3-5min（鍋蓋打開）5、上樣待濃縮膠完全凝固后，將封口膜取下把膠板放于電泳槽中。加入電泳緩沖液（加滿），拔出梳子，用微量加

4、樣針在各加樣孔中加入適量體積的處理過的蛋白樣品（加樣針先插入底部然后慢慢上移緩慢加樣）。若有不用的加樣孔，可加入上樣緩沖液（如：緩沖液-蛋白樣品-marker-緩沖液-蛋白樣品-緩沖液，將順序記在本上）。6、電泳：接通電源，進行電泳（根據(jù)分子量大小設置電壓，分子量小采用低電壓以降低電泳速度）。一般溴酚藍跑到底部時結(jié)束電泳（因電泳時產(chǎn)熱，電泳儀周圍最好放置冰袋）。7、轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后，將含有目的蛋白的分離膠切割下來，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中；根據(jù)膠的大小剪裁等面積的6張濾紙（略短于膠1mm）和1張PVDF膜（大于20KD的蛋白勇0.45um的膜；小于20KD的蛋白就要用0.2um的膜），剪裁的PVDF膜可

5、比膠的長寬各長出1mm左右。6張濾紙放入轉(zhuǎn)移緩沖液中；PVDF膜先放入甲醇中活化（不能超過15sec），再放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min后（若檢測小于20KD的蛋白縮短或省略平衡步驟），依次在石墨電極上疊放3張濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE凝膠和另外3張濾紙，用玻璃棒趕出氣泡。接通電源，40min60min轉(zhuǎn)膜結(jié)束(根據(jù)分子量大小定時間，分子量大可增加轉(zhuǎn)膜時間)。8、封閉：將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入5%脫脂奶粉或1%BSA中（小袋），振蕩封閉至少1h。9、與一抗結(jié)合用抗體稀釋液將一抗按1：10002000稀釋。將PVDF膜直接放入一抗稀釋液中（小袋），室溫振蕩孵育2h或4過夜。10、洗膜：用

6、TBST洗膜，10min/次，共3次。11、與二抗結(jié)合將洗后的PVDF膜放入二抗溶液中，二抗的稀釋度為1：20005000。室溫振蕩孵育1h。12、洗膜：用TBST洗膜，10min/次，共3次。13、化學發(fā)光、顯影、定影此操作在暗室中進行。將發(fā)光試劑A和B等體積混合后加在PVDF膜的蛋白面上，室溫下孵育3min。將PVDF膜用保鮮膜包好放在暗盒內(nèi)（必須保持干燥）。在紅燈下取出X膠片，放在膜上，根據(jù)信號的強弱調(diào)整曝光時間。曝光結(jié)束后取出X膠片（從30sec開始試），浸入顯影液中顯影，顯影25min，用水終止顯影。然后將X膠片浸入定影液中，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。1

7、4、結(jié)果處理：將膠片進行拍照。用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。附：用于Western blot實驗所需溶液的配制1、30%丙烯酰胺貯存液：稱取14.5g丙烯酰胺和0.5g N-N-甲叉雙丙烯酰胺，將其溶于50ml三蒸水中，棕色瓶中避光保存。2、SDS-PAGE電泳緩沖液：稱取14.4g甘氨酸，3g Tris堿和1g SDS溶于1L三蒸水中，不用調(diào)pH。3、分離膠緩沖液（4×） 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8稱取18.15g Tris堿，將其溶于80ml三蒸水中，用濃鹽酸調(diào)pH到8.8（約需濃鹽酸45ml），加三蒸水至100ml。4、濃縮膠緩沖液（4×）

8、 0.5mol/L Tris-Cl pH6.8稱取6g Tris堿，將其溶于80ml三蒸水中，用濃鹽酸調(diào)pH到6.8（約需濃鹽酸3ml），加三蒸水至100ml。5、10%過硫酸銨：稱取0.1g過硫酸銨溶于1ml水中。現(xiàn)用現(xiàn)配（或冰箱保存不超過兩周）。6、10%SDS：稱取5g SDS溶于50ml三蒸水中，室溫保存。7、考馬斯亮藍染色液：0.25%考馬斯亮藍R-250，50%甲醇，7%冰乙酸稱取1.25g考馬斯亮藍R-250，加入250ml甲醇，35ml冰乙酸，補充蒸餾水至500ml，濾紙過濾后置棕色瓶中保存，可重復使用。8、考馬斯亮藍脫色液：30%甲醇，7%冰乙酸。（或：甲醇：冰乙酸：ddH2O=3:1:6）9、TBST（tris buffer solution with tween-20）：20mmol/L Tris-Cl（pH7.5），500mmol/L NaCl，0.05%tween-20。稱取Tris堿1.21g，NaCl 14.6g，將其溶于500ml蒸餾水中，加入610滴濃鹽酸，調(diào)pH到7.5左右，加入250l tween-20。10、轉(zhuǎn)移緩沖液：39mM甘氨酸，48mM Tri