1、3福建省重中之重“福建省海洋生物優良種質和生物活性物質的應用基礎研究”項目(19982002資助。葉海輝,博士,講師,E 2mail :haihuiye 1通訊作者收稿日期:2003202219,收修改稿日期:2003205220南美白對蝦(Penaeus vannamei 視神經節和腦免疫細胞化學研究3葉海輝王桂忠 金朱興 李少菁 1黃輝洋 陳錦民(廈門大學海洋系亞熱帶海洋研究所;廈門大學生命科學學院細胞生物學研究室廈門361005(廈門大學海洋系亞熱帶海洋研究所廈門361005提要應用抗脊椎動物52羥色胺、神經肽Y 、2內啡肽、P 物質、生長抑素、胰高血糖素、催乳素抗體和S ABC 免疫細

2、胞化學方法,對南美白對蝦視神經節和腦進行了免疫細胞化學研究。結果表明,前4種抗體呈現免疫陽性反應:52羥色胺免疫陽性細胞分布于視神經節的視神經層、視內髓和視端髓;前腦前中細胞群,中腦嗅葉內側細胞群、嗅葉外側細胞群以及前腦中部的前端神經髓質呈免疫陽性反應。神經肽Y 免疫陽性細胞分布于視神經節的4個神經髓;前腦前中群細胞和前腦中部的前端神經髓質也呈陽性反應。P 物質免疫陽性細胞位于前腦前中群。2內啡肽免疫陽性細胞僅分布于后腦后側群。4種免疫陽性物質特異性的分布模式,為其可能參與調節神經內分泌活動提供了形態學證據。關鍵詞南美白對蝦,視神經節,腦,免疫細胞化學中圖分類號Q952胺類和肽類是甲殼動物體內

3、重要的生物活性物質,可作為激素、神經遞質、神經調質參與調節生命活動。迄今,已從甲殼動物神經系統檢測出52羥色胺、多巴胺、腦啡肽、內啡肽、P 物質、催產素、血管緊張素、促黑色素激素、神經肽Y 、生長抑素、胃泌素、降鈣素等物質(Fingerman et al ,1993,1994;Harzsch et al ,2002。視神經節和腦是甲殼動物神經內分泌中心,對蛻皮、生殖、血糖濃度變化和色素遷移等生理活動具有重要的調節作用(Fingerman ,1997a ;Hu 2berman ,2000。開展生物活性物質在腦和視神經節分布的定位研究,可為了解其神經活動機制提供基礎資料。南美白對蝦(Penaeus

4、 vannamei 隸屬甲殼綱(Crustacea 、十足目(Decapoda 、游泳亞目(Natantia 、對蝦科(Penaeidae 、對蝦屬(Penaeus ,是當今世界養殖產量最高的三大優良蝦類的養殖種類之一。目前,有關南美白對蝦的研究,主要集中在水產養殖和病害防治方面(劉恒等,1998;于琳江等,2001;雷質文等,2002,尚未見有神經內分泌生理學方面的報道。本研究應用52羥色胺、神經肽Y 、P 物質、2內啡肽、胰高血糖素、生長抑素和催乳素抗體進行了免疫細胞化學檢測,結果發現前4種抗體呈現免疫陽性反應,其余抗體為陰性反應。4種免疫陽性物質特異性的分布模式,為其可能參與調節神經內分

5、泌活動提供了形態學證據。1材料與方法111取材與切片南美白對蝦18只,雌雄兼有,體長11.413.8cm ,體重12.317.2g ,購自廈門農貿市場,全部為活體材料。迅速解剖出腦和視神經節,于B ouin s 液固定1618h ,常規脫水透明,石蠟包埋,連續橫切或縱切,切片厚度6m ,間隔取片,按順序貼片,37恒溫箱干燥備用。112主要試劑兔抗脊椎動物52羥色胺(serotonin ,52HT 、P 物第35卷第1期海洋與湖沼V ol.35,N o.12004年1月OCE ANO LOGIA ET LI MNO LOGIA SINIC AJan.,2004質(substance P,SP、2

6、內啡肽(2Endorphin,2E p、生長抑素(s omatostatin,SS、胰高血糖素(glucag on, G lu、催乳素(proctolin,PR L抗體為美國Z ymed公司產品。兔抗神經肽Y(neuropeptide Y,NPY抗體和DAB為美國Sigma公司產品。鏈霉菌抗生物素蛋白2過氧化物酶免疫細胞化學試劑盒(S ABC kit購自武漢博士德公司。NPY抗體為即用型工作液,其余6種抗體的稀釋度均為150。113SABC免疫細胞化學程序切片脫蠟止水。3%H2O2/P BS室溫孵育10min,以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水浸洗,P BS浸泡5min。滴加正常山羊血清(1

7、10孵育10min,封閉非特異性反應部位。傾去血清,滴加第一抗體,37孵育1.5h。P BS浸洗3次×5min。滴加即用型生物素標記的羊抗兔抗體,37孵育0.5h。P BS浸洗3次×5min。滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白2過氧化物酶,37孵育0.5h。P BS浸洗3次×5min。0.06%DAB20.03%H2O2顯色510min。自來水沖洗,蘇木精復染,脫水,透明,封片。陰性對照實驗采用相鄰切片,以正常羊血清代替第一抗體,同步進行上述免疫細胞化學反應程序。2結果南美白對蝦的腦由前腦、中腦和后腦組成,左右兩側互為鏡像。視神經節由外向內,可分為視神經層(lamina

8、 ganglionaris,LG、視外髓(medulla externa, ME、視內髓(medulla interna,MI和視端髓(medulla terminalis,MT等4部分。多數免疫陽性細胞的胞質呈棕褐色,內有黑褐色的陽性反應顆粒,少數細胞陽性反應較淺,細胞質中的反應顆粒顏色較淡;細胞核空泡狀,為陰性反應。實驗對照組結果均為陰性。211視神經節52HT免疫陽性細胞在LG內緣、ME內外緣、MI 內外緣和MT外緣都有零星散布(圖1a,MT中陽性細胞體積較大(圖1b,在MT近視神經處也見到陽性細胞。NPY免疫陽性細胞在LG內緣分布較多,排成一列。ME外緣陽性細胞很小(圖1c,在ME內緣

9、、MI內緣與MT外緣也檢測到陽性細胞(圖1d,e。除LG外,其他3個神經髓質都有陽性反應。MT中的陽性反應髓質集中在MT外側細胞群附近。視神經節中未檢測到SP免疫陽性反應和2E p 免疫陽性反應。212腦52HT免疫陽性反應強,陽性細胞位于前腦和中腦,細胞數量最多的部位是中腦嗅葉外側群(圖1f,其次是嗅葉內側細胞群(圖1g,在前腦的前中群也檢測到少量免疫陽性細胞(圖1h。但神經髓質中只有前腦中部的前端神經髓檢測到陽性反應(圖1h。NPY免疫陽性細胞只位于前腦前中群,有的細胞陽性反應較弱,另有一些細胞陽性反應強,染色深(圖1i。前腦中部的前端神經髓質呈免疫陽性反應,嗅葉免疫陽性較弱,染色淺。SP

10、免疫陽性細胞僅分布于前腦前中群(圖1j。2E p免疫陽性細胞位于后腦后側群,免疫陽性反應較弱(圖1k。3討論31152HT免疫陽性反應52羥色胺又稱血清動素(serotonin,屬于一種重要的生物胺。應用免疫細胞化學、放射免疫法和色譜等技術,在甲殼動物的視神經節、腦、腹神經鏈、圍食道神經節、口胃神經節和圍心器等處,都檢測出52HT,52HT在甲殼動物神經系統的廣泛分布反映了其生理作用的多樣性(Fingerman et al,1994。52HT陽性細胞在視神經節的分布有不少報道。黃道蟹(Cancer antennarius的ME和MI外緣52HT細胞多,竇腺下方和X器各有1個細胞(Rudolph

11、 et al, 1990。同樣,軟尾太平蛄(Pacif astacus leniusculus的ME和MI外緣也散布一些陽性細胞,但神經纖維的陽性反應更強烈,在ME和MI各自形成3條陽性反應帶。MT的陽性細胞主要分布于腹面外緣。視神經節內有陽性神經纖維進入前腦(Elofss on, 1983。南美白對蝦視神經節的4個髓中都有52HT 陽性細胞分布,但神經髓質未見陽性反應,這與上述種類差異頗大,而與鋸齒長臂蝦(Palaemon serratus的結果相似(Bellon2Humbert et al,1988。研究表明,52HT對視神經節多種神經激素的分泌具有調節作用,如促進紅色素擴散激素(red

12、pigment dispersing horm one的分泌,從而調節小網膜細胞的光敏感桿束的活動;誘導光敏小網膜細胞中的近端小網膜色素(proximal retinal pigment遷移到完全黑暗的位置;增強離體眼柄X器內蛻皮抑制激素(m olt inhibiting horm one,MIH的合成分泌;刺激竇腺中甲殼動物高血糖素(crustacean hyperglycemie horm one,CHH的釋放(Fingerman et al,1994。南美白對蝦視神經節中1期葉海輝等:南美白對蝦(Penaeus vannamei視神經節和腦免疫細胞化學研究79圖1南美白對蝦視神經節和腦的

13、免疫細胞化學反應Fig.1Immun oreactivity of the optic ganglia and the brain of Penaeus vannameia.LG內緣的52HT免疫陽性細胞;b.MT中52HT免疫陽性細胞;c.ME外緣NPY免疫陽性細胞;d.ME內緣的NPY免疫陽性細胞;e.MI內緣的NPY免疫陽性細胞;f.嗅葉外側群的52HT免疫陽性細胞;g.嗅葉內側群的52HT免疫陽性細胞;h.前腦前中群細胞(和前腦中部的前端神經髓(呈52HT免疫陽性反應;i.前腦前中群的NPY免疫陽性細胞;j.前腦前中群SP免疫陽性細胞;k.后腦后側群2E p免疫陽性細胞。放大倍數均為&

14、#215;330較廣泛分布的52HT免疫陽性物質,提示52HT在神經細胞內可能起著神經遞質的作用,參與了有關神經激素的合成與釋放作用。軟尾太平蛄腦的前中區、后中區和嗅葉內側的細胞群均有52HT陽性細胞,前腦橋、中央體和嗅葉等多個神經髓質也有陽性反應(Elofss on,1983。南美白對蝦前腦中部的前端神經髓質、前腦的前中群、嗅葉內側群和嗅葉外側群都呈52HT陽性反應。Johanss on(1991將嗅葉內側的細胞群中的嗅覺中間神經元分為:52HT陽性大型細胞和52HT陽性小型細胞:羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii只有大型細胞,刺鎧蝦(Munida sarni只有小

15、型細胞,而軟尾太平蛄和互愛蟹(Hyas araneus兼具兩種細胞。嗅覺中間神經元類型的不同反映了嗅覺信息加工處理過程的差異。南美白對蝦嗅葉內側細胞群的52 HT陽性神經細胞也只有一種類型,即為組織學觀察中的型神經細胞。據美國Tulane大學Fingerman 課題組的報道,52HT能夠刺激克氏原螯蝦(Procam2 barus clarkii和大西洋招潮蟹(Uca pugilater的腦、胸神經節分泌性腺刺激激素(g onad stimulating horm one, G SH,從而促進性腺發育(Fingerman,1997b。Vaca 等(2000也發現注射52HT可以促進南美白對蝦卵8

16、0海洋與湖沼35卷 巢成熟和產卵。本研究發現,南美白對蝦腦內52HT 免疫陽性強,為52HT 可能參與南美白對蝦G SH 分泌活動提供了形態學依據。312NPY 免疫陽性反應NPY 為胰多肽家族的一個成員,對脊椎動物的攝食、性行為、血壓和生理節律等生理活動起著重要的調節作用(H oyle ,1998。迄今,NPY 在甲殼動物分布的研究甚少,僅發現海蛄(Homarus gam 2 marus ME 和MI 具有少量NPY 陽性細胞,竇腺呈陽性反應(Charmantier 2Daures et al ,1987。南美白對蝦視神經節的4個神經髓均有NPY 陽性細胞;除LG 外,其他3個神經髓質都呈陽

17、性反應。南美白對蝦前腦中部的前端神經髓質、嗅葉和前腦前中群呈NPY 陽性反應,這與陸生的蟹(Chiro 2mantes haematocheir 是一致的(H onma 2Y oshiharu et al ,1996。南美白對蝦NPY 免疫陽性物質分布前腦與嗅葉的特點,或許提示了NPY 參與嗅覺形成和攝食活動的生理作用。迄今,從原生動物、腔腸動物、甲殼動物和脊椎動物中均發現NPY 的存在(張小云等,1993;顧靜雄等,1998。鑒于NPY 在不同門類動物中的分布,可以認為NPY 在生物系統發生過程中具有一定的保守性。313SP 免疫陽性反應SP 廣泛分布于脊椎動物神經系統和外周器官中,與興奮平

18、滑肌、舒張血管、促進腺體分泌、興奮脊髓運動神經元、參與軸突反射、調節水平衡以及與痛覺感受和傳遞有密切關系(顧增發,1985。應用脊椎動物SP 抗體在龍蝦(Panulirus inter 2ruptus 視神經節的4個神經髓及竇腺,大西洋招潮蟹的小網膜細胞和4個神經髓及竇腺都檢出陽性反應(Mancillas et al ,1981;Fingerman et al ,1985。SP 在竇腺中的分布,表明SP 具有神經激素的作用。但南美白對蝦視神經節中未檢出陽性反應。雜色瘦方蟹(Leptograpsus variegatus 和粗螯蛄(Cherax destructor 的前腦和中腦各有2個大型SP

19、 陽性細胞,胞突末梢最終進入嗅葉內(Sandeman et al ,1990。美洲螯龍蝦(Hamarus americanus 腦內SP 陽性分布極其廣泛,除中腦嗅葉束神經髓質、第一觸角中央神經髓質、第一觸角兩側神經髓質外,其他神經髓質和各細胞群均呈陽性反應(Lang w orthy et al ,1997。南美白對蝦僅在前腦的前中群中檢測出SP免疫陽性細胞,神經髓質呈陰性反應,SP 樣物質分布模式與上述甲殼動物相差甚遠,可能為物種差異造成。3142Ep 免疫陽性反應2E p 主要由下丘腦弓狀核及垂體中葉合成分泌,除了具有鎮痛和維持神經內分泌相對穩定的作用以外,它可以通過相應的受體作用于淋巴母

20、細胞對免疫系統產生廣泛的作用(曹莉等,1999。甲殼動物神經系統2E p 的研究很少。南美白對蝦視神經節未檢測出陽性反應,但后腦后側群中檢測出2E p 免疫陽性細胞,有關生理功能尚待進一步研究。本實驗中,G lu 、SS 和PR L 呈陰性反應,但陰性結果并不能說明抗原不存在,可能由于以下原因導致陰性反應:這些物質的分子結構迥異于脊椎動物,即種屬差異;南美白對蝦體內這些物質的含量太低,超出本實驗方法的測試范圍;實驗所采用的固定方法對于這些物質來說并非適宜,從而導致抗原失活;或許與本實驗南美白對蝦所處的蛻皮周期、生殖周期等生理狀態有關。本實驗檢測到52HT 、NPY 、SP 和2E p 免疫陽性

21、反應,但由于一個特定的抗體只能識別肽類分子結構的某一部分,因此單純根據免疫細胞化學方法,還不能排除某些與脊椎動物神經肽相類似的分子(如只差個別的氨基酸與抗體發生非特異性的交叉反應,即僅用免疫細胞化學的方法,只能說明所測得的免疫陽性物質的結構與脊椎動物相應的肽類物質相似,還不能完全確定這些物質的結構。要正確識別實驗所測得的肽類物質,應采用氨基酸順序不同的特異性抗體,并輔以其他分離技術,如離子交換層析法、凝膠層析法和色譜等方法;而從化學上鑒定其氨基酸組成則是最可靠的方法。但本文的研究結果至少說明,南美白對蝦體內有些細胞和神經纖維含有可以同脊椎動物抗體結合的抗原決定部位。這些陽性抗原可能與脊椎動物神

22、經肽類完全相同,或者是其同源物質。參考文獻于琳江,于奎杰,張乃禹,2001.南美白對蝦人工繁育技術的初步研究.海洋與湖沼,32(5:575580劉恒,李光友,1998.免疫多糖對養殖南美白對蝦作用的研究.海洋與湖沼,29(2:113118張小云,盧麗,邱子健等,1993.棘尾蟲類神經肽的免疫細胞化學研究,實驗生物學報,26(4:483491顧靜雄,羅振國,張小云,1998.水螅NPY 類似物的分布定位.動物學研究,19(4:331333顧增發,1985.P 物質.見:王志均主編.胃腸激素.北京:科學出版社,297311曹莉,蔣春雷,路長林,1999.2內啡肽的免疫調節作用.生理科1期葉海輝等:

23、南美白對蝦(Penaeus vannamei 視神經節和腦免疫細胞化學研究81學進展,30(1:3840雷質文,黃,史成銀等,2002.白斑綜合癥病毒(WSS V的宿主調查.海洋與湖沼,33(3:250258Bellon2Humbert C,Van Herp F,1988.Localization of serotonin2like im2 munoreactivity in the eyestalk of the prawn Palaemon serratus(Crus2 tacea,Decapoda,Natantia,J M orphology,196:307320 Charmantier

24、2Daures M,Danger J M,Netchitailo P et al,1987.Immunocy2 tochemical evidence for atrial natriuretic factor2like and neuropeptide Y2 like peptides in the eyestalks of Homarus gammarus(Crustacea,De2 capoda.C om ptes rendus de l academie des sciences serie2sciences de la vie2life sciences,305:479483E lo

25、fss on R,1983.52HT2like immunoreactivity in the central nerv ous systemof the cray fish,Pacifastacus leniusculus.Cell and T issue Research, 232:221236Fingerman M,1997a.Crustacean endocrinology:a retrospective,prospective and introspective analysis.Physiological Z oology,70(3:257269 Fingerman M,1997b

26、.R oles of neurotransmitters in regulating reproductive horm one release and g onadal in decapod crustaceans.Invert Reprod De2 velp,31(1:4754Fingerman M,Hanumante M M,K ulkarni G K et al,1985.Localization of Substance P2like,leucine2enkephalin2like,methionine2enkephalin2like, and FMRFamide2like immu

27、noreactivity in the eyestalk of the fiddler crab,Uca pugilator.Cell and T issue Research,241:473477 Fingerman M,Nagabhushanam R,Sarojini R,1993.Vertebrate2T ype H or2 m ones in Crustaceans2Localization,Identification and Functional S ignifi2 cance.Z oological Science,10(1:1329Fingerman M,Nagabhushan

28、am R,Sarojini R et al,1994.Biogenic amines in crustaceans:identification,location and roles.J Crustacean Biology, 14(3:413437Harzsch S,G lotzner J,2002.An immunohistochemical study of structure and development of the nerv ous system in the brine shrim p Artemia salina Linnaeus,1758(Branchiopoda,Anos

29、tracawith remarks on the ev olu2 tion of the arthropod brain.Arthropod S tructure&Development,30:251270H onma2Y oshiharu,T akano2K eiko,Chiba2Akira et al,1996.Immunohisto2chemical localization of neuropeptides in the cephalic ganglion of the land crab Chiromantes haematocheir.Fisheries2Science2T

30、 oky o,62(6: 909913H oyle C,1998.Neuropeptide families:ev olutionary perspectives.RegulatoryPeptides,73:133Huberman A,2000.Shrim p endocrinology:a review.Aquaculture,191: 191208Johanss on K U I,1991.Identification of different types of serotonin2like im2 munoreactive olfactory interneurons in four i

31、n fraorders of decapod crus2 taceans.Cell and T issue Research,264:357362Langw orthy K,Helluy S,Benton J et al,1997.Amines and peptides in the brain of the American lobster:immunocytochemical localization patterns and im plications for brain function.Cell and T issue Research,288:(1:191206M ancillas

32、 J R,M cG inty J F,Selverston A I et al,1981.Immunocyto2 chemical localization of enkephalin and Substance P in retina and eye2 stalk neurons of lobster.Nature,293:576578Resch2Sedlmeier G,Sedlmeier D,1999.Release of digestive enzymes from the crustacean hepatopancreas:effect of vertebrate gastrointe

33、stinal hor2 m ones.C om parative Biochemistry and Physiology B2biochemistry& M olecular Biology,123:187192Rudolph P H,S paziani E,1990.Distribution of serotonergic neurons in the eyestalk and brain of the crab,Cancer antennarius.C om parative Biochemstry and Physiology,97C:241245Sandeman R E,San

34、deman D C,W ats on A,1990.Substance P Antibody Reveals H om olog ous Neruons with Ax on T erminals am ong s omata in the cray fish and crab brain.J C om parative Neurology,294:569582 Vaca A,Alfaro J,2000.Ovarian maturation and spawning in the white shrim p,Penaeus vannamei,by serotonin injection.Aqu

35、aculture,182: 37338582海洋與湖沼35卷1期 葉海輝等 : 南美白對蝦 ( Penaeus vannamei 視神經節和腦免疫細胞化學研究 83 IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDIES ON THE OPTIC GANG IA AND THE L BRAIN OF P ENA EUS VANNAM EI YE Hai2Hui , WANG Gui2Zhong , J IN Zhu2Xing , LI Shao2Jing , HUANG Hui2Yang , CHEN Jin2Min ( Department of Oceanography , Institut

36、e of Subtropical Oceanography of Xiamen University ; Laboratory of Cell Biology , School of Life Science , Xiamen University , Xiamen , 361005 ( Department of Oceanography , Institute of Subtropical Oceanography of Xiamen University , Xiamen , 361005 Abstract Amines and peptides are important substa

37、nces of biological activity in crustaceans. In the life process they play the role of hormone , neurotransmitter and/ or neuromodulator , the optical ganglia and the brain are the center of neuroendocrinology in crustaceans , exerting significant modulation in molting , reproduction and other physic

38、al activities. Penaeus vannamei , despite chemistry techniques were used to observe the immunoreactive neurons and neuropils in the optic ganglia and brain of P. van2 proofs for its engagement in the secretion of GSH ( gonad stimulating hormone . The specific distribution patterns of immunoreac2 bio

39、logical limits of this research. Key words Penaeus vannamei , Optic ganglia , Brain , Immunocytochemistry © 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. tive cells existed in the anterior median cluster of protocerebrum and the posterior lateral cluster of

40、tritocerebrum respectively. of neuromodulator in the nerve cells. The 52HT immunoreactivity in the cerebrum of P. vannamei may supply morphological tive substances against NPY, Ep , SS and SP may also supply morphological proofs for their different neurophysiological func2 2 tions. No immunoreativities were found against SS , G and PRL. However , it cannot be concluded that these 4 corresponding lu antigen do not actually exist in the nervous system of P