1、專題二專題二 流式細胞儀流式細胞儀寧夏大學生命科學學院寧夏大學生命科學學院郝秀靜郝秀靜 BD是世界上最大的研發、生產和銷售醫是世界上最大的研發、生產和銷售醫療設備，醫療系統和試劑的醫療技術公療設備，醫療系統和試劑的醫療技術公司之一；司之一； 公司的業務可分為公司的業務可分為BD醫療、醫療、BD診斷和診斷和BD生物科學三大類；生物科學三大類； 1897 BD在紐約創立。在紐約創立。 1898 BD就開始生產玻璃、金屬注射器和體溫計。就開始生產玻璃、金屬注射器和體溫計。 1961 BD發明了世界上第一支一次性塑料注射器和一次發明了世界上第一支一次性塑料注射器和一次性醫用針頭，進入一次性醫用產品階段

2、；性醫用針頭，進入一次性醫用產品階段； 1973 BD推出全球第一臺商業化流式細胞儀，確立了在推出全球第一臺商業化流式細胞儀，確立了在細胞學研究領域的領先地位。細胞學研究領域的領先地位。 1975 BD生產了世界上第一臺生產了世界上第一臺BACTEC110血培養儀。血培養儀。 1986 BD推出細胞分析史上第一個雙色熒光直接標記的推出細胞分析史上第一個雙色熒光直接標記的試劑。試劑。 1995 BD生產出當今世界唯一的全自動四色流式細胞分生產出當今世界唯一的全自動四色流式細胞分析分選儀。析分選儀。 2008 BD推出升級型流式細胞分選儀推出升級型流式細胞分選儀BD FACSAria II。 19

3、73年世界第一臺商品化的流式細胞儀年世界第一臺商品化的流式細胞儀FACS I由由BD公司和美國斯坦福大學共同研制成功；公司和美國斯坦福大學共同研制成功； 1980年北京師范大學引進了中國的第一臺流式年北京師范大學引進了中國的第一臺流式細胞儀細胞儀FACS II 。 BD是全球最大的流式細胞儀生產商和供應商，是全球最大的流式細胞儀生產商和供應商，在全球的占有率為在全球的占有率為75%，在中國，在中國75% 。美國貝克曼庫爾特有限公司是一家開發和銷售儀器，生化，軟件以及能夠簡化和自動化實驗室處理產品的公司，貝克曼庫爾特公司一直專注于顆粒分析的研究開發與應用。 流式細胞術（流式細胞術（Flow Cy

4、tometry, Flow Cytometry, 簡稱簡稱FCMFCM）是一種可以）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分狀態中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術，析定量的技術，同時可以對特定群體加以分選同時可以對特定群體加以分選。 流式細胞儀（流式細胞儀（Flow Cytometer）集激光技術、電子物）集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技化學技術

5、、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。儀器。流式細胞儀基本概念流式細胞儀基本概念 研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等；生物及人工合成微球等； 研究的微粒特性包括多種物理及生物學研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量（如大小，內部結構，特征，并加以定量（如大小，內部結構，DNA，RNA，蛋白質，抗原等，蛋白質，抗原等)； 檢測直線流動狀態中的單個細胞或顆粒；檢測直線流動狀態中的單個細胞或顆粒；由液流包裹，再外力作用下。由液流包裹，再外力作用下。采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單采用激光作為激發光源，保證其具有更好的單色

6、性與激發效率；色性與激發效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速的多個參數信號進行數據處理分析，保證了檢測速度與統計分析精確性。度與統計分析精確性。 基本工作原理基本工作原理 流式細胞術的特點流式細胞術的特點 檢測速度快，分析樣本量大：檢測速度快，分析樣本量大： 在極短時間內可分析大量細胞，這是流式不同于其在極短時間內可分析大量細胞，這是流式不同于其他細胞分析儀器的主

7、要特點，只要標本中的細胞數他細胞分析儀器的主要特點，只要標本中的細胞數量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘成千上萬個細胞的量足夠，流式細胞儀可以每秒鐘成千上萬個細胞的速率進行測量，測量的細胞總數可達數千、數萬乃速率進行測量，測量的細胞總數可達數千、數萬乃至數百萬個至數百萬個 ； 可同時分析單個細胞的多種特征：可同時分析單個細胞的多種特征： 使用不同熒光素標記的單克隆抗體或熒光染料對細使用不同熒光素標記的單克隆抗體或熒光染料對細胞進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，可獲得胞進行多色熒光染色，通過流式細胞分析，可獲得單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數更為單細胞的多種信息，使細胞亞群的識別、計數更為準

8、確；準確； 強大的分選功能：強大的分選功能： 在分析的同時可以對特定群體加以分選。在分析的同時可以對特定群體加以分選。 保持細胞完整性保持細胞完整性 流式細胞術最大的特點是能在保持細胞流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態下，通過熒光探針的協助，從分的狀態下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量、分選定量、分選流式檢測的樣本流式檢測的樣本 可檢測的樣本

9、種類多樣：可檢測的樣本種類多樣：各種細胞（如外周血，骨髓，細針穿刺，灌洗各種細胞（如外周血，骨髓，細針穿刺，灌洗液，實體組織，懸浮或貼壁培養的細胞），微液，實體組織，懸浮或貼壁培養的細胞），微生物，人工合成微球等生物，人工合成微球等New!New!血清、血漿、培養上清、細胞裂解液血清、血漿、培養上清、細胞裂解液 樣本制備：樣本制備： 單細胞懸液（天然，機械研磨單細胞懸液（天然，機械研磨/ /消化）消化） 5 510105 51 110107 7cells/mlcells/ml，約，約0.50.51ml1ml，300300目目篩網過濾篩網過濾流式細胞儀的檢測范圍流式細胞儀的檢測范圍 細胞結構細胞

10、結構 細胞大小細胞大小 細胞顆粒度細胞顆粒度 細胞表面積細胞表面積 核漿比例核漿比例 DNADNA含量與細胞周含量與細胞周期期 RNARNA含量含量 蛋白質含量蛋白質含量 細胞功能細胞功能 細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的特異性抗核的特異性抗原原 細胞活性細胞活性 細胞內細胞內/ /外的細胞因子外的細胞因子 激素結合位點、細胞受體激素結合位點、細胞受體 蛋白磷酸化蛋白磷酸化 pHpH值值 鈣離子濃度鈣離子濃度 細胞膜電位、線粒體膜電位細胞膜電位、線粒體膜電位 （1 1） 液流系統液流系統（2 2） 光學系統光學系統（3 3） 數據處理系統數據處理系統流式細胞儀的基本結構：流式細胞儀的基

11、本結構： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測細胞待測細胞 單個細胞的懸液單個細胞的懸液 熒光染料標記的熒光染料標記的單抗對其染色單抗對其染色 受清潔氣體壓力受清潔氣體壓力 從樣品管進從樣品管進入流動室形成樣本流入流動室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。（1）液流系統）液流系統噴嘴噴嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocus

12、ed laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系統示意圖液流系統示意圖FCMFCM的液流系統（如的液流系統（如何形成單個細胞流）何形成單個細胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器（488,633488,633） 分色反光鏡：反射長分色反光鏡：反射長/ /短波長，通過短短波長，通過短/ /長長波長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內光透鏡組：形成平行光，除去室內光 濾片：長通、短通、帶通濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（

13、散射光），（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）（2）光學系統）光學系統FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光學系統示意圖光學系統示意圖主要由計算機及其軟件組成主要由計算機及其軟件組成（3）數據處理系統）數據處理系統單細胞液柱單細胞液柱已標記的單細已標記的單細胞懸液和鞘液胞懸液和鞘液硅化管硅化管流動室流動室噴嘴噴嘴熒光檢測系統和熒光檢測系統和散射光感受系統散射光感受系統收集光信號收集光信號熒光染料被熒光染料被

14、激發發光激發發光光電倍增管光電倍增管脈沖信號脈沖信號算機系統分算機系統分析結果析結果放大放大垂直相交垂直相交形成穩態形成穩態水平激光與之水平激光與之基本過程基本過程區別區別流式細胞儀流式細胞儀顯微鏡顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對象對象細胞、生物粒子細胞、生物粒子細胞、組織等細胞、組織等承載工具承載工具鞘液及流動室鞘液及流動室載玻片載玻片檢測信號檢測信號光學信號光學信號形態及染色形態及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學放大物鏡、光學放大統計統計計算機，計算機，50005000人工，人工，200200結果結果多參數，綜合分析多參數，綜合分析簡單

15、，單參數簡單，單參數流式細胞儀與顯微鏡的區別流式細胞儀與顯微鏡的區別 細胞在液柱中與激光束相交時細胞在液柱中與激光束相交時向周圍向周圍360立體角方向散射的光線立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為為前向散射光前向散射光和側向散射光側向散射光。一、散射光的測定一、散射光的測定散射光信號散射光信號 與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。）。與激光束垂直的稱為側向角散射光信號（與激光束垂直的稱為側向角散射光信號（SSC）。）。散射光信號散射光信號R

16、ight Angle Light Right Angle Light Detector Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Forward Light Detector Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource= 前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積細胞相對大小及其表面積

17、= 側向角散射光（側向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter）細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性前向角散射光信號前向角散射光信號 前向散射光（前向散射光（forward scatter, FSforward scatter, FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比性，信號強弱與細胞體積大小成正比。側向角散射光信號側向角散射光信號

18、測得的測得的FSCFSC與與SSCSSC信號通過計算機信號通過計算機處理，可得到處理，可得到FSC-FSC-SSCSSC圖，用散射光信圖，用散射光信號對未染色的活細號對未染色的活細胞進行分析或分選。胞進行分析或分選。 此為血細胞分類此為血細胞分類的基本原理。的基本原理。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 外周全血細胞散射光雙參數點圖外周全血細胞散射光雙參數點圖（紅細胞溶解后）（紅細胞溶解后） 顆粒雜質、氣泡顆粒雜質、氣泡對檢測的影響對檢測的影響 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料

19、受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。 每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。光信號區分開，送入不同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。多個不同特征。 線性放大器和對數放大器線性放大器和對數放大器二、熒光測量二、熒光測量熒光素的激發和發射光譜熒光素的激發和發射光譜 任何發熒光的物質分子都具有這

20、兩個特征光譜任何發熒光的物質分子都具有這兩個特征光譜（nm） 激發光譜（激發光譜（Excitation，Ex）：）： 是指能特異性地激發某種熒光素的一定波長范圍內的光是指能特異性地激發某種熒光素的一定波長范圍內的光線，也稱為吸收光譜。線，也稱為吸收光譜。 吸收波峰（最大吸收波長）：吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max 發射光譜（發射光譜（Emission，Em）：）： 是指某一波長激發光引起熒光素發射的一定波長范圍內是指某一波長激發光引起熒光素發射的一定波長范圍內的熒光的熒光 發射波峰（最大發射波長）：發射波峰（最大發射波長）：Em-Max 熒光素的使用：熒光素的使用： 選擇正確的激光器選擇

21、正確的激光器 確定所需探測器（確定所需探測器（PMT）區別區別488nm 520nm異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC）熒光信號熒光信號 使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色使用不同熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析分析 熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光樣本制備熒光樣本制備雙色直接染色雙色直接染色光學系統：濾光片光學系統：濾光片 如何將一束混合的熒光區分開來，分別進行收集呢？如何將一束混合的熒光區分開來，分別進行收集呢？ 濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍范圍 Long

22、pass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP)460 500 540460 500 540460 500 540FACSCalibur光學濾片光學濾片檢測器組檢測器組（激光器）（激光器）PMT位位置置帶通帶通/長通透長通透鏡鏡適用染料適用染料488nm藍色激藍色激光光FL1530/30FITCFL2585/42PE, PIFL3670 LPPerCP,PerCP-Cy5.5, PE-Cy7635nm紅色激紅色激光光FL4661/16APCFluorescence Spectrum Viewer Fluorescence Spectrum Viewer Fluoresce

23、nce Spectrum Viewer Fluorescence Spectrum Viewer Fluorescence Spectrum Viewer Fluorescence Spectrum Viewer Fluorescence Spectrum Viewer 液流系統：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，液流系統：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經檢測的樣本和而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。鞘液流向廢液桶。光學系統：經熒光染色的細胞在激光的照射下產生散射光學系統：經熒光染色的細胞在激光的照

24、射下產生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（管（PMT）接收，熒光信號經一系列雙色性反射鏡和帶）接收，熒光信號經一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號電子系統：熒光信號和散射光信號經二極管和電子系統：熒光信號和散射光信號經二極管和PMT接收后接收后可轉換為電信號，再通過模可轉換為電信號，再通過模/數轉換器轉換為可被計算機識數轉換器轉換為可被計算機識別的數字信號，以列表模式存儲，最終以圖形形式呈現別的數字信號，以列表模式存儲，最終以圖形形式呈現 通過

25、流式細胞儀進行細胞分選通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養和研究時進行的。進一步培養和研究時進行的。細胞分選原理細胞分選原理細胞懸液形成液流柱細胞懸液形成液流柱流動室振動流動室振動液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細胞的液滴含細胞的液滴棄去棄去偏轉落入收集器偏轉落入收集器壓電晶體壓電晶體產生產生機械振動機械振動不充電不充電充電充電分選基本原理分選基本原理分選的基本原理分選的基本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS Senso

26、rFluorescence detector陽性選擇陽性選擇MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分離磁珠分離陰性選擇陰性選擇 分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。的含量成正比。幾千個細胞幾千個細胞/ /秒秒 分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。 99.5%99.5%左右左右 分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的

27、比率。與純度成反比。分選細胞之間的比率。與純度成反比。90-95%90-95% 分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。比。（二）分選的技術要求（二）分選的技術要求流式數據分析形式流式數據分析形式數據存儲數據存儲 FCS 2.0格式格式 常以列表模式（常以列表模式（LIST MODE)：將每個細胞的每：將每個細胞的每個檢測參量依次排列順序存儲個檢測參量依次排列順序存儲FSC SSC FL1 FL2Eventve

28、nt 210016024585Event 3300650160720FITC/PE雙染樣本雙染樣本數據顯示數據顯示 直方圖（直方圖（Histogram） 二維點圖（二維點圖（Dot Plot） 等高線圖（等高線圖（Contour Plot） 密度圖（密度圖（Density） 三維圖（三維圖（3D Plot）等）等單參數直方圖分析單參數直方圖分析l 熒光峰的高低即在縱軸對應的高度反映了？熒光峰的高低即在縱軸對應的高度反映了？l 熒光峰的高低即在縱軸對應的高度反映了具熒光峰的高低即在縱軸對應的高度反映了具有此種熒光強度的細胞在樣本中所占比例的相有此種熒光強度的細胞在樣本中所占比例的相對多少，而非絕

29、對數目對多少，而非絕對數目雙參數散點圖分析雙參數散點圖分析等高圖和密度圖等高圖和密度圖流式對照的設置流式對照的設置熒光染色對照的設置熒光染色對照的設置1 陰性對照陰性對照 空白對照空白對照 自發熒光，即不經熒光染色細胞內部熒光分子經光照自發熒光，即不經熒光染色細胞內部熒光分子經光照發出的熒光。自發熒光信號為噪聲信號。一般說來，發出的熒光。自發熒光信號為噪聲信號。一般說來，細胞成分中能產生自發熒光的分子（核黃素、細胞色細胞成分中能產生自發熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強，如腫瘤細胞、粒素等）的含量越高，自發熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越高自發熒光越強細胞

30、等；樣本死細胞比例越高自發熒光越強 實驗樣本實驗樣本 特異熒光，即抗體特異熒光，即抗體F(ab)2段與細胞抗原特異結合上的段與細胞抗原特異結合上的熒光染料受光照發出的熒光熒光染料受光照發出的熒光 非特異熒光，即抗體非特異熒光，即抗體Fc段與細胞表面的段與細胞表面的Fc受體非特異受體非特異結合上的熒光染料受光照發出的熒光結合上的熒光染料受光照發出的熒光 自發熒光特異熒光非特異熒光自發熒光特異熒光非特異熒光 同型對照（自發熒光非特異熒光）同型對照（自發熒光非特異熒光）合適？合適？同型對照同型對照同型對照（同型對照（Isotype Control） ： 與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞

31、型與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型 （即（即Fc段相同，段相同， F(ab)2段不同）段不同） 與染色的單克隆抗體與染色的單克隆抗體 相同種屬來源相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標記相同熒光素標記 相同劑量和濃度相同劑量和濃度 但由未免疫動物血清純化而來但由未免疫動物血清純化而來 用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體而產生的背景染受體而產生的背景染色色 例如，標記例如，標記FITC的單克隆抗體為小鼠的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標記亞類抗體，標記PE的單克隆的單克隆抗體為小鼠抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應用相同濃度和劑量的未