1、hGDF5基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響(1)目的 探討人生長分化因子5(hGDF5)基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖及分化的影響。方法 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將hGDF5基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的兔BMSCs，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、間接免疫熒光檢測hGDF5 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并通過檢測堿性磷酸酶活性、細(xì)胞增殖能力(MTT法)、型膠原(Col)以及蛋白多糖(PG)的表達(dá)，分析轉(zhuǎn)染hGDF5對BMSCs增殖、分化的影響。結(jié)果 hGDF5 mRNA及蛋白在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá)；hGDF5基因轉(zhuǎn)染組和對照組相比，Col、PG表達(dá)水平顯著增高(P0.01，P0.

2、05)。結(jié)論 外源基因轉(zhuǎn)染可以使BMSCs表達(dá)有生物活性的hGDF5。高表達(dá)的hGDF5可以促進(jìn)BMSCs向軟骨表型分化，但對細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性無明顯影響。關(guān)鍵詞：生長分化因子5；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染；分化ABSTRACT: Objective To investigate the effects of gene transfection with human growth/differentiation factor 5(hGDF5)on the differentiation and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal

3、 stem cells (BMSCs). Methods BMSCs were obtained from adult New zealand rabbits and purified by gradient centrifuge .Exogenous recombinant human GDF5 was transfected into BMSCs with liposome method. Then hGDF5 expression at mRNA and protein level was measured separately by reverse transcriptionpolym

4、erase reaction and indirect immunofluorescence method. Activity of alkaline phosphates (ALP), expression of Typecollagen (Col), proteoglycan and growth of the cells were all measured by biological methods to evaluate the effects of hGDF5 gene transfer on the differentiation and proliferation of rabb

5、it BMSCs. Results After hGDF5 gene transfection, BMSCs expressed hGDF5 mRNA and protein, and compared with the control groups, expression of proteoglycan and Col increased significantly, but no significant difference appeared in ALP activity and cell proliferation. Conclusion Gene transfer with hGDF

6、5 is an effective way to enhance the expression of GDF5 at mRNA and protein. The expression of heterogenetic hGDF5 gene can induce BMSCs differentiation to chondrogenic cells.But the gene transfection has no obvious effects on the proliferation and ALP activity of BMSCs. KEY WORDS:growth/differentia

7、tion factor 5 (GDF5); bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs); gene transfection; differentiation骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是來源于中胚層的未分化細(xì)胞，因其具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能在組織工程學(xué)領(lǐng)域受到人們的關(guān)注。大量研究證實(shí)，BMSCs在骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)下可以向成軟骨或成骨分化，復(fù)合生物材料移植體內(nèi)可以有效地促進(jìn)組織缺損的修復(fù)。生長分化因子5(growth/differentiation factor 5

8、, GDF5)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)家族中與眾不同的成員，是機(jī)體軟骨形成、骨骼發(fā)育過程中重的調(diào)節(jié)因子。其與細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合移植皮下或肌肉中可以形成軟骨或肌腱樣組織，局部應(yīng)用可以顯著促進(jìn)骨、軟骨、肌腱、韌帶損傷的修復(fù)，從而在組織工程方面展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景1。我們采用分子生物學(xué)手段將hGDF5基因體外轉(zhuǎn)染兔BMSCs，初步觀察轉(zhuǎn)染后hGDF5的表達(dá)及其對干細(xì)胞增殖、分化的影響，為將來用于基因加強(qiáng)組織工程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 主試劑和儀器 pCA350hGDF5質(zhì)粒(含hGDF5編碼序列)、pcDNA3.1( )載體由西安交通

9、大學(xué)疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室許鵬博士惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶BamH、Not購自美國New England Biolabs公司；脂質(zhì)體、Trizol試劑盒為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品；GDF5單克隆抗體購自美國RD公司；Col單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司；免疫組化試劑盒及羊抗兔IgGFITC購自北京中山生物技術(shù)有限公司。酶聯(lián)免疫檢測儀系華東電子管廠生產(chǎn)；堿性磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成生物制品公司。1.2 pcDNA3.1( )/hGDF5真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 登錄GenBankNM 000557獲Human GDF5 cDNA、對照目的基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1( )限制性內(nèi)切

10、酶譜，設(shè)計(jì)引物。引物5端和3端分別引入BamH、Not酶切位點(diǎn)，上游引物為5GCTGTTCTGGATCCTGTCATTCAGGGGCTGGCC3，下游引物為5TATTCTTACGCCGGCGGCCAGTGCTGCTACCTGCAGC3。以pCA350hGDF5質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1( )質(zhì)粒分別經(jīng)BamH、Not酶切，T4DNA 連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，氨芐青霉素篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切、測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1( )/hGDF5。擴(kuò)大培養(yǎng)堿裂法大量抽提重組質(zhì)粒。1.3 BMSCs的取材與培養(yǎng) 取健康新西蘭大白兔(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

11、中心提供)6只，3月齡，體質(zhì)量2.5-3.0kg，雌雄不拘。腹腔注射鹽酸氯氨酮(50mg/kg)麻醉，嚴(yán)格消毒后，用20mL注射器(內(nèi)含100U/mL肝素的5mL生理鹽水)帶16號針頭自脛骨上端穿刺抽取骨髓，雙側(cè)共抽取5-6mL，LDMEM混勻，沿管壁加入含等量1.073g/mL percoll液的離心管中，1500r/min 離心25min，小口吸管緩慢吸取中間界面云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層， PBS 洗2 次，加入LDMEM完全培養(yǎng)基含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS，青霉素鈉100U/mL，鏈霉素100g/mL。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1106/mL，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、37飽和濕度培養(yǎng)箱。

12、3d后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞。此后每3、4d換液1次，至10-12d。細(xì)胞基本鋪滿單層，2.5g/L胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以2105/mL密度傳代培養(yǎng)。1.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的hGDF5轉(zhuǎn)染BMSCs 傳代培養(yǎng)的BMSCs約60%融合時(shí)，用胰酶消化，接種于24孔培養(yǎng)板,分為hGDF5轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。每組3復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至2106，加LDMEM培養(yǎng)基(含10黃,不含抗生素)；待細(xì)胞70%-80%融合時(shí)，用無血清DMEM培養(yǎng)基換液備用。DNA/脂質(zhì)體混合物的配制：將60L DAN質(zhì)粒滴入滅菌離心管中，以3mol/L醋酸鈉和無水乙醇沉淀，12000r/min離心1min后棄去上清

13、液,用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇漂洗后再離心，吸去上清，用100L滅菌三蒸水溶解DNA，加入60L脂質(zhì)體混勻，室溫放置30min，加入無血清DMEM培養(yǎng)基。吸去培養(yǎng)基,按組相應(yīng)加入上述混合物或單純脂質(zhì)體，0.3mL/孔。37放置4h，再加入足量的無血清DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12h。吸去培養(yǎng)上清后，加入含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的LDMEM培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后用G418篩選至陽性克隆形成(約20d)，擴(kuò)大培養(yǎng)用于檢測指標(biāo)。作者：任曉勇，張銀剛，陳文弦【關(guān)鍵詞】生長分化因子5摘目的探討人生長分化因子5(hGDF5)基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理

14、餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞GDF5表達(dá)的檢測 取傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對照細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明提取總RNA。根據(jù)GenBank Human GDF5cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物：上游引物5CGAAGCGGGCCTTAATCT3，下游引物5CGTGGTCAGGAAGCAGAG3(443bp)。以GAPPH為內(nèi)參照,上游引物5GCTTCACCACCTTCTTGATG3；下游引物5GTCAAGGCCGAGAATGGGAA3(198bp)。采用QIAGEN OneStep RT

15、PCR 試劑盒反應(yīng)體系。RTPCR條件為：54 30min, 95 15min，94 1min，52 1min，72 1min，30 個(gè)循環(huán)，72 延伸5min。1.5g/L瓊脂凝膠電泳。另取上述各組細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液,加鼠抗人GDF5單克隆抗體，37下孵育2h后，PBS沖洗，涼干。再用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37封閉30min，PBS漂洗，加入DAPI室溫下孵育5min，甘油封片,熒光顯微鏡觀察。1.6 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性 取上述各組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。第1、3、5、7、9日同一時(shí)點(diǎn)，每組隨機(jī)選3孔，棄去培養(yǎng)液，加入20L MT

16、T(5g/L)，繼續(xù)孵育4h后棄去上清,加入100L DMSO，振蕩混勻，室溫下放置30min，在酶標(biāo)儀490nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，根據(jù)所測數(shù)值繪制細(xì)胞生長曲線。1.7 堿性磷酸酶活性檢測 取上述各組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以1106/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別于第2、4、6、8、10、12日消化細(xì)胞，調(diào)成2105/mL，取1mL加入等量0.1g/L TritonX100，振蕩混勻，于4冰箱中過夜。反復(fù)吹打后,按堿性磷酸酶試劑盒操作步驟進(jìn)行，570nm用酶標(biāo)儀分光光度計(jì)測出其吸光度(A)值。1.8 細(xì)胞外基質(zhì)的檢測 取上述各組細(xì)胞爬片(每組10張)，丙酮固定，行Col免疫組化檢

17、測及甲苯胺藍(lán)染色。CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定染色的吸光度。200倍鏡下切片隨機(jī)選擇3-5個(gè)陽性視野測量吸光度，取其均值代表該標(biāo)本的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果以(s)表示。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間Col免疫組化及甲苯胺藍(lán)染色的吸光度比較采用最小顯著差法，不同時(shí)點(diǎn)各組間堿性磷酸酶活性和增殖活力(A值)的比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA )。以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 雙酶切電泳圖出現(xiàn)約5.3kb和1.5kb兩條片斷，單酶切電泳獲6.8kb大小片斷，和質(zhì)粒載體及hGDF5cDNA預(yù)計(jì)值大小符合 (圖1

18、)。質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定和GenBank hGDF5cDNA序列一致。圖1 PcDNA3.1( )/hGDF5質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（略）Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of PcDNA3.1( )/hGDF51,3: pcDNA 3.1( )/hGDF5cDNA digested by enzyme BamHand Not; 2: pcDNA 3.1( )/hGDF5cDNA digested by enzyme BamH; 4: marker2.2 轉(zhuǎn)染后hGDF5的表達(dá) RTPCR結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)約443bp大小電泳條帶，而未轉(zhuǎn)染組和空

19、載體轉(zhuǎn)染組則未出現(xiàn)(圖2)。熒光顯微鏡下觀察可見，hGDF5轉(zhuǎn)染組爬片視野中可見胞漿中散在的綠色熒光，而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組則僅顯示DAPI標(biāo)記的藍(lán)色熒光 (圖3) 。圖2 轉(zhuǎn)染后BMSCs中hGDF5mRNA的表達(dá)（略）Fig.2 Expression of hGDF5 mRNA in BMSCs after tranfection1:marker; 2,3: BMSCs transfected with pcDNA3.1( )/hGDF5cDNA; 4: BMSCs transfected with pcDNA3.1( ); 5: normal BMSCs圖3 免疫熒光檢測BMSCs中h

20、GDF5蛋白的表達(dá)（略）Fig.3 Detection of hGDF5 expression by immunofluorescencea: BMSCs transfected with pcDNA 3.1( )/hGDF5; b:control cells2.3 MTT法檢測結(jié)果 MTT比色法檢測結(jié)果顯示， hGDF5基因轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)細(xì)胞約在第3天進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天進(jìn)入平臺期，第8-9天生長開始減慢，生長曲線和對照組基本相似。hGDF5基因轉(zhuǎn)染組吸光度(A)值在各時(shí)點(diǎn)均高于空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，但差異并無顯著性(P=0.117，圖4)。2.4 堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果 堿性磷酸酶活性隨時(shí)

21、間延長，有逐漸上升趨勢。hGDF5轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組在不同觀察時(shí)點(diǎn)的吸光度無顯著差異(P=0.273，圖5)。2.5 細(xì)胞外基質(zhì)的檢測結(jié)果 Col免疫組化結(jié)果顯示，基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞漿出現(xiàn)較明顯的棕色顆粒，而對照組顯色較弱(圖6)。甲苯胺藍(lán)染色顯示，基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞漿呈較深蘭紫色，而對照組著色極弱(圖7)。切片經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析，基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞型膠元表達(dá)(以積分吸光度表示，下同)和和對照組比較有顯著差異(P=0.006，P=0.007)；基因轉(zhuǎn)染組蛋白多糖(PG)表達(dá)(以積分吸光度表示，下同)和對照組比較有顯著差異(P=0.006，P=0.009，表1)。圖4 轉(zhuǎn)染hGDF5基因?qū)MSC

22、s增殖活力的影響(MTT比色法)（略）Fig.4 Effects of hGDF5 gene transfer on the proliferation of BMSCs圖5 轉(zhuǎn)染hGDF5基因?qū)MSCs ALP活性的影響（略）Fig.5 Effects of hGDF5 gene transfer on the ALP activity of BMSCs表1 BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)染色的吸光度值（略）Table 1 Immunohistochemical distribution of Col and PG in BMSCs by means of image analysis圖6 免疫組化

23、檢測BMSCs中Col的表達(dá)（略）Fig.6 Detection of Col expression in BMSCs with immunohistochemistry (SABC 200)a: immunohistochemical staining of Col in BMSCs transfected with hGDF5 gene; b:immunohistochemical staining of Col in control cells圖7 BMSCs中蛋白多糖的表達(dá)（略）Fig.7 Detection of PG in BMSCs (Toludine staining 200)

24、a: toludine blue staining in BMSCs transfected with hGDF5 gene; b: toludin blue staining in control cells3 討論GDF5是機(jī)體軟骨形成、骨骼發(fā)育的重調(diào)節(jié)因子之一，其基因突變或缺失將導(dǎo)致嚴(yán)重的肢體畸形23。外源重組的GDF5因子和生物基質(zhì)材料復(fù)合，移植于骨、軟骨、肌健以及韌帶缺損處，能顯著提高組織的愈合速度和質(zhì)量，但直接應(yīng)用卻存在著作用時(shí)間短、效價(jià)低以及反復(fù)使用費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，因此嘗試把GDF5的基因治療引入組織工程學(xué)領(lǐng)域成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。我們采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源hGDF5基

25、因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)RTPCR、免疫熒光檢測表明轉(zhuǎn)染基因在mRNA和蛋白水平得到了較為穩(wěn)定的表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行GDF5基因組織工程研究奠定了基礎(chǔ)。作者：任曉勇，張銀剛，陳文弦【關(guān)鍵詞】生長分化因子5摘目的探討人生長分化因子5(hGDF5)基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。為了證實(shí)外源基因產(chǎn)物對BMSCs生物行為的影響，我們對BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果表明，hGDF5基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞合成

26、細(xì)胞外基質(zhì)的能力增強(qiáng)，Col和PG表達(dá)水平與對照組比較均顯著上調(diào),提示hGDF5有誘導(dǎo)BMSCs向軟骨表型分化的作用。有關(guān)GDF5在機(jī)體軟骨形成發(fā)育中的作用一直受到人們的重視。Coleman4 通過將外源GDF5轉(zhuǎn)染雞胚間充質(zhì)細(xì)胞，使其過度表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在軟骨形成初期GDF5主是促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的黏附、聚集和軟骨分化，后期則表現(xiàn)為顯著促進(jìn)軟骨的成熟和肥大。Bai等5將GDF5和TGF結(jié)合在體外可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化。除此之外，GDF5誘導(dǎo)骨膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞向軟骨分化的作用也已經(jīng)被體外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)67。Gruber7還對GDF5等對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響做了進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)BMSCs前

27、型膠元A表達(dá)上調(diào)，但卻沒有軟骨成熟膠元前型膠元B表達(dá)的跡象。我們通過脂質(zhì)體將外源hGDF5基因成功轉(zhuǎn)入BMSCs,其基因蛋白表現(xiàn)出良好的促進(jìn)干細(xì)胞軟骨分化的生物活性，為應(yīng)用該手段構(gòu)造工程化軟骨以及用于體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。堿性磷酸酶活性是反映BMSCs分化的一個(gè)重指標(biāo)。目前對GDF5調(diào)節(jié)堿性磷酸酶活性的作用并不完全清楚。Gruber7研究認(rèn)為，在無血清培養(yǎng)條件下GDF5可以促進(jìn)骨髓干細(xì)胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達(dá)升高，使細(xì)胞表現(xiàn)出成骨活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，但這種作用和BMP其他成員(BMP6和BMP7)相比弱得多。Koch等8觀察了外源重組GDF5作用下BMSCs成骨相關(guān)基因mR

28、NA以及堿性磷酸酶活性的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Col基因和Runx2基因表達(dá)先上調(diào)隨后很快降低，并低于對照組，而Osterix基因始終未見表達(dá)；細(xì)胞的堿性磷酸酶活性在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間并無明顯不同。我們觀察了外源基因hGDF5表達(dá)對BMSCs的堿性磷酸酶活性的影響，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞隨著時(shí)間的延長堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)出增高趨勢，但在不同時(shí)點(diǎn)各組之間并無顯著差別。體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞堿性磷酸酶活性的增高，可能在一定程度上受到了培養(yǎng)基成分(如胎牛血清)的影響。另外，我們通過MTT比色法檢測了基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖力的影響，結(jié)果顯示，在各個(gè)觀察時(shí)點(diǎn)，hGDF5基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活力和對照組相比有一定程度的增高

29、，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明hGDF5基因轉(zhuǎn)染并未引起B(yǎng)MSCs的過度增殖或抑制，較好地保持了細(xì)胞原有的生長狀態(tài)。由于外源hGDF5基因轉(zhuǎn)染BMSCs可以獲得具有生物活性的GDF5蛋白的表達(dá)，并在體外表現(xiàn)出良好的成軟骨誘導(dǎo)作用，加上BMSCs本身來源豐富、取材方便、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將轉(zhuǎn)染GDF5基因的BMSCs和細(xì)胞外基質(zhì)材料相結(jié)合構(gòu)造工程化軟骨，或自體移植修復(fù)軟骨缺損無疑具有廣闊的發(fā)展前景。參考文獻(xiàn)：1Spiro RC, Liu L, Heidaran MA, et al. Inductive activity of recombinant human growth and differentiation factor5 J. Biochem Soc Trans, 2000,28(4):362368.2Nakamura K, Shirai T, Morishita S, et al. p38 mitogenactivated protein kinase functionally contributes to chondrogenesis induced by growth/differentiation factor5 in ATDC5 cells J. Exp Cell Res,1999