1、苦參堿對臍靜脈內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶基因表達的影響 11-03-20 16:24:00 作者：熊建團，姜怡鄧編輯：studa20【摘要】 目的 觀察不同濃度苦參堿對人臍靜脈內(nèi)皮細胞一氧化氮生成及一氧化氮合酶活性的影響。方法 采用體外培養(yǎng)第3代人臍靜脈內(nèi)皮細胞。實驗分為6組，即對照組、不同濃度苦參堿組(50、100、200、500和1000g/L)。各組細胞于培養(yǎng)24h 后收集標本，用Griess法檢測培養(yǎng)上清中一氧化氮水平，并測定人臍靜脈內(nèi)皮細胞的一氧化氮合酶活性及用內(nèi)參半定量法分析iNOS mRNA的變化。結果 不同濃度苦參堿組一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性、RNA的表達水平較對照組明顯升高(

2、P0.05)。結論 苦參堿可增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞的一氧化氮合酶活性和一氧化氮產(chǎn)生及RNA的表達水平。 【關鍵詞】 苦參堿；一氧化氮合酶活性；內(nèi)皮細胞；一氧化氮Abstract：Objective To investigate effects of constant matrine on nitric oxide(NO)production and nitric oxide synthase(NOS)activity in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods The third passage of cultured HU

3、VEC were used.The cells were divided into six groups：control group，diferent matrine group(50g/L，100g/L，200g/L，500g/L，1000g/L)Samples were collected 24h after culturing.NO levels in the supernatant were determined using Griess reagent，and NOS activity of hUVEC was dedected.and iNOS mRNA was determine

4、d by reversetranscription PCR(RTPCR).Semiquantitative analysis of the RTPCR products was made with a transilluminator. Results NO levels、NOS activity、the level of mRNA expression in matrine group were significantly higher than that in controls(P0.05).Conclusion Matrine can excite NO production and N

5、OS activity in HUVEC and intensitydependently antagonize the effects on NO production.The iNOS mRNA expression will increased when the matrine dosage reaches a certain level.Key words：endothelial cells；nitric oxide；nitric oxide synthase苦參(Sophova Flavescens Ait)是豆科槐屬植物苦參的干燥根，“性寒味苦”入心、脾、腎三經(jīng)，始載于神農(nóng)本草經(jīng)，

6、列為中品，謂其“主心腹積氣，瘕積聚”，能“安五臟，定志益精”。本草經(jīng)百種錄稱“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經(jīng)之火”。苦參中的活性成分苦參堿(Matrine)具有較為廣泛的生物學作用。據(jù)報道苦參堿具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、降血脂等作用1-4。本研究觀察了苦參堿對內(nèi)皮細胞一氧化氮的影響，以探討苦參堿改善血管內(nèi)皮功能的可能性，為預防動脈粥樣硬化(AS)提供依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料 細胞M199培養(yǎng)基、10mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素，DAB顯色試劑盒為北京中山生物工程公司產(chǎn)品，Trizo為

7、Invitrogen公司產(chǎn)品，PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。CMIAS多功能真彩圖像分析儀為北京航空航天大學產(chǎn)品。1.2 方法取新鮮嬰兒臍帶，D-Hanks液沖洗，注入0.1mg/L膠原酶，置37 D-Hanks液中消化15min，收集酶液，1000r/min 離心5min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，以2105/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶，于37、飽和濕度、50mL/L CO2條件培養(yǎng)，24h后換液。待細胞長滿瓶后，1g/L胰酶消化、傳代35代細胞用于實驗。 取生長狀況良好的第3代細胞，以1107個細胞數(shù)接種于96孔板，每孔加入100L細胞懸液，每組5個復孔，并同時進行細胞爬片。細胞在接近

8、融合生長時，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。實驗隨機分為6組：對照組不予苦參堿干預；苦參堿組在培養(yǎng)基中加入苦參堿，劑量分別為50、100、200、500、1000g/L。各組細胞接種數(shù)目及培養(yǎng)條件一致，均于24h后收集培養(yǎng)液和細胞標本。 用Griess法測定培養(yǎng)基中一氧化氮的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2-)濃度。測定方法按照NO試劑盒說明書操作。收集的培養(yǎng)液與Griess試劑1%對氨基苯磺酰胺，0.1%N(1萘基)乙二胺，2.5 %磷酸反應，721分光光度計檢測，從亞硝酸鈉標準曲線上換算NO值，以fmol/d 表示。 按照NOS試劑盒說明書操作。NOS活性測定原理：NOS催化L-精氨酸和分子氧反應

9、形成NO，NO與親合性物質(zhì)生成有色化合物，在530nm波長下測定吸光度，以此代表細胞NOS活性。細胞破碎采用超聲波法裂解，蛋白定量采用Lowry法。酶活性定義為每毫克組織蛋白酶中生成1nmol NO為一個活性單位。NOS活性=(測定管吸光度-空白管吸光度)呈色物納摩爾消光系數(shù)(反應液總體積取液量)1/(比色光徑時間)樣品蛋白質(zhì)含量，其中呈色物納摩爾消光系數(shù)為38.310-6。 以Trizol試劑提取細胞總RNA。經(jīng)0.9%瓊脂糖凝膠電泳(50mV，1h)確定提取RNA的質(zhì)量。用核酸定量儀測定樣品在260nm處的吸光度(1A=40g/mL)，確定RNA的濃度。所用RNA的A260/A280應控制

10、在1.80以上。 取1L RNA(1g/L)作cDNA模板，以oligodT為引物，按試劑盒操作順序依次加樣，總反應體積為20L，反應混合物于42 孵育45 min，目的基因iNOS引物序列及內(nèi)參物-actin引物序列參照文獻5設計。iNOS引物序列為：上游5-CCAGCTAGCCAAAGTCACCAT-3；下游5-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3；擴增產(chǎn)物為353bp.-actin(5)，5-caccacaccttctacaatgagc-3；-actin(3)，3-gtgatctccttctgcatcctgt-3擴增產(chǎn)物為695bp。將逆轉錄產(chǎn)物進行iNOS和-actin同管擴增。條件為94變性后進行下列循環(huán)：94 30s，57 30s，72 40s，循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(110 mV，30min)分析測定A值。R=(NOS-背景)/(-actin背景)，R為iNOS mRNA相對于-actin的相對含量。1.3 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以(s)表示，進行ANOVA 統(tǒng)計學分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果21 苦參堿對一氧化氮濃度和NOS活性的影響(表1)表1 對人內(nèi)皮細胞中NO和NOS活性的影響(略) HUVEC與苦參堿共同培養(yǎng)24h，細胞上清NO 濃度