1、SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測 楊曉菲1 邱耕2 葉松山1 丁肖華1 歐志英1 王偉毅2 何蘊韶2 【摘要】目的建立SYBR Green I實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)技術檢測DNA甲基化的方法，為應用FQ-PCR高通量、準確檢測DNA甲基化奠定實驗基礎。方法正常基因組DNA經修飾后進行PCR，構建含有DNA甲基化-actin的重組質粒，克隆陽性質粒作為標準品用SYBR Green I實時熒光定量PCR進行檢測，建立檢測的標準曲線，進行方法學指標評價。45例標本分別用TaqMan熒光定量PCR(Methylight)和SYBR Gree

2、n I熒光定量PCR檢測，將兩種方法進行比較。結果SYBR Green I FQ-PCR、Methylight和ABI的SYBR Green I Master Mix試劑盒的檢測靈敏度均為78個拷貝。MSP的檢測靈敏度為7.8 ×103 拷貝。標本用兩種定量方法檢測所得結果用配對t檢驗進行統計分析，t值為-0.78，0.4【關鍵詞】 DNA甲基化；熒光定量PCR；SYBR green I Quantitative detection of DNA Methylation by Fluorescent quantitative real time PCR using SYBR Gree

3、n I YANG Xiaofei, QIU Geng, YE Songshan, DING Xiaohua, OU Zhiying, WANG Weiyi, HE Yunshao. Daan Gene Diagnostic center, SUN YAT-SEN University, GUANGZHOU, 510080, CHINA. 【Abstract】Objective To establish the SYBR Green I fluorescent quantitative PCR method for accurate detection of DNA Methylation. M

4、ethods The 133bp bisulfate-treated ACTB gene was amplified and cloned into T vector which was transformed into E.coli DH5. Following extracting and identifying， the positive recombinant plasmid was used as quantitative template to generate standard curve. Clinical samples which were acquired from HC

5、C patients and normal people were examined by two methods, fluorescent quantitative PCR by“Taqman”probe (Methylight) and by SYBR Green I dyes. The Ct (Threshold Cycle) Value generated were compared by statistic method. Results The sensitivity of SYBR Green I FQ-PCR, Methylight, and ABI SYBR Green I

6、Master Mix were 78copies.But Methylation specific PCR could only detect 7.8×103copies. the result of samples detected by two different quantitative real time PCR were analyzed by random paired t test, and t value was -0.78, 0.4【Key words】DNA Methylation; Fluorescent quantitative PCR; SYBR Green

7、 I 近期，關于表觀遺傳學(epigenetics)與腫瘤發生關系的研究日益增多1，2。癌癥甚至可以被認為是由DNA的突變和表觀遺傳學的改變共同導致3，而且表觀遺傳學的變化在腫瘤發生中早于DNA的突變4。作為表觀遺傳學重要組成部分的DNA甲基化，無疑成為腫瘤早期診斷的研究熱點。特定基因Cp G島甲基化異常改變是主要的表觀遺傳學改變之一 ，是一種在突變、缺失、異位等序列變異之外的非序列性變化5。這種表觀遺傳學異常不僅與復制延遲、染色體壓縮、轉錄抑制密切相關 ，而且與疾病尤其是腫瘤的易感性、發生發展、預后和轉歸均有密切關系。檢測甲基化的相關技術也隨著甲基化研究的深入而不斷推陳出新。 對DNA甲基化

8、進行檢測的方法有很多，包括甲基化特異性PCR(MSP)， Methylight，COBRA等6。這些方法應用的前提是DNA需要經過亞硫酸氫鹽修飾。修飾后沒有甲基化的胞嘧啶會轉變為尿嘧啶，而發生了甲基化的胞嘧啶則保持不變。MSP7就是針對這兩種情況，設計不同的引物來擴增甲基化和非甲基化的DNA，通過電泳結果來判定特定位點的甲基化情況。該方法靈敏度可以滿足大多數實驗研究的要求，不過它不能定量，難以自動化。檢測DNA甲基化的TaqMan熒光定量PCR，即Methylight8，就是在MSP的基礎上設計一條TaqMan探針，通過檢測熒光信號的增加來定初始模板的量，該法定量的準確性和檢測的靈敏度都很高，

9、但因需要設計合成特異的探針而使其的應用受限9，而且TaqMan探針費用昂貴。而SYBR Green I 熒光定量PCR（FQ-PCR）則克服了上述方法的缺點，該法無需設計合成特異的探針，可以直接將MSP的方法轉為定量的方法，缺省了普通PCR后續的電泳和成像的過程，更適合應用于臨床檢測。 本研究構建了含有甲基化-actin基因片段的標準品質粒，成功建立SYBR Green I 熒光定量PCR檢測DNA甲基化的標準曲線，并比較了它與MSP及其他定量檢測方法的方法學評價指標。最后通過對比試驗證明了本方法與Taqman熒光方法具有相同的檢測效能。為今后應用SYBR Green I熒光定量PCR方法檢測

10、DNA甲基化的臨床應用奠定了實驗基礎。 1 材料和方法 1.1 主要試劑及儀器 DNA marker、Taq DNA Polymerase （1U/l）購自Fermentas；dNTPs、pMD 18-T vector ( T載體) 、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖、蛋白酶K均購自TaKaRa 公司; QIAmp Blood Mini kit(Qiagen)；引物和TaqMan探針由中山大學達安基因診斷中心合成;重組質粒DNA測序(上海生工公司); 其他低耗品均為國產分析純。ABI9700定性PCR儀、ABI7000 熒光定量PCR儀及分析軟件均購自美國ABI(原PE)公司。SYBR G

11、reen I熒光染料為美國ABI公司隨機附送。SYBR Green I master Mix 試劑盒購自美國ABI公司。 1.2 研究對象 正常人的血液標本1例，肝癌病人的肝組織標本31例，正常肝組織標本14例。所有病人的平均年齡45.17歲，均為漢族，其中女性3名。 1.3 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 運用QIAmp Blood Mini kit(Qiagen)抽提正常人外周血白細胞（WBC），組織標本運用QIAmp DNA Mini Kit（Qiagen）進行抽提。DNA用亞硫酸氫鈉修飾6 ：2.0ug基因組DNA稀釋成45l體積，加入新鮮配置的3M NaOH5l，420C水浴20min。

12、加入新鮮配制的亞硫酸氫鈉（4.2M，pH5.0）520l，氫醌（10mM）30l，輕輕混勻。石蠟油封閉后，550C水浴16h。DNA樣本修飾結束后用Wizard Clean-up System（Promega）脫鹽。加入20ul 3M NaOH，37，15 min水浴中止反應，并用無水乙醇和NH4OAc（10M，pH7.0）沉淀。40ul TE融解DNA后，-20保存。 1.4引物和探針的設計和合成 根據文獻10設計出針對亞硫酸氫鈉修飾的-actin基因的引物和探針。上、下游引物序列分別為：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT；AACCAATAAAACCTACTCC TCCCTT

13、AA；探針為6FAM5ACCACCACCCAACACACAATAACAAAC ACA-3TAMRA。利用引物合成軟件Oligo 6.0評價無誤后進行合成。 1.5 甲基化-actin基因熒光定量PCR標準品質粒的構建 常規PCR 以及產物膠回收：反應總體積25l，其中10× Taq buffer with (NH4)2SO4 750 mM Tris-HCl，200mM (NH4)2SO4， 0.1% Tween 202.5 l，MgCl2 （25 mM）3 l， dNTPs ( 10pmol/l)0.5l，上下游引物(10pmol/l) 各0.5l，模板2l，TaqDNA聚合酶1l

14、( 1U/l) ，滅菌去離子水15 l。反應體系經94預變性4 min進入循環，94 30 s，60 30 s，72 30 s，共40 個循環，最后一個循環后72 延伸7min。產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收。PCR 產物的克隆：TaqDNA聚合酶在擴增產物3末端會加上A，其可與T載體配對，即TA克隆。將回收片段與載體按摩爾比5：1的比例在DNA連接酶作用下連接，構建擴增產物的重組質粒。將重組質粒轉化入DH5感受態細菌中，在含Amp 的LB 平板上進行篩選，經定性PCR初步鑒定后，提取質粒后進行測序分析。 1.6 SYBR Green I熒光定量PCR檢測甲基化-actin基

15、因反應條件的優化 依據曲線的擴增效率、線性和重復性等對熒光定量PCR反應的條件進行摸索。PCR反應參數的優化：兩步法或三步法的確定，兩步法即是省略普通PCR中的延伸步驟，而將退火的時間延長。三步法則是保留延伸的步驟。退火溫度從58°C-62°C，每度一個梯度進行摸索。對反應體系中關鍵物質Mg2 +濃度、引物濃度等進行摸索，以期找到擴增曲線效率高，無非特異性擴增、檢測靈敏度高、重復性好的最佳反應條件。 1.7定量標準曲線的建立 將經測序鑒定好的甲基化-actin基因陽性質粒測定吸光度A 值，利用公式OD值×50×10-3×6.26×10

16、23/324.5×bp數拷貝/ml計算拷貝數/ml，用去離子水進行10倍倍比稀釋，梯度為1012 102 拷貝/ml濃度梯度，在最佳反應條件下用定量PCR儀同時擴增并進行融解曲線分析。反應結束后計算機自動繪制標準曲線和融解曲線。 1.8 SYBR Green I熒光定量PCR法實驗室指標評價 靈敏度試驗：將甲基化-actin基因陽性質粒進行梯度稀釋，最小稀釋度達到100拷貝/ml。在最佳反應條件下，經過多次檢測后確定本實驗的最小的檢測限。特異性試驗：用鑒定好的兩個梯度的陽性質粒作為陽性模板，同時將經亞硫酸氫鈉修飾過的正常人基因組DNA作為陽性對照，陰性對照包括未加入模板的對照和未經過

17、亞硫酸氫鈉修飾的正常人基因組DNA，同時將這些模板進行熒光定量PCR反應。重復性試驗： 在最佳反應條件下，進行連續6次熒光定量PCR反應，每次做3個平行管，計算批內及批間循環閾值(Ct)的變異系數。 1.9 三種方法檢測甲基化-actin基因稀釋質粒 用MSP，SYBR Green I Master Mix試劑盒， Methylight方法檢測1012102拷貝/ml的稀釋質粒進行檢測。SYBR Green I Master Mix的反應條件按照試劑盒中的說明書進行，反應采用二步法，50，10min；95 5 min； 95 15 s； 60 1min共40個循環。Methylight方法的反

18、應條件進行優化后在最佳反應條件下進行。分別測出3種方法的檢測靈敏度，與本實驗的SYBR Green I方法進行比較。 1.10 對比實驗 分別用Methylight和本實驗中的SYBR Green I定量PCR法檢測肝癌及正常標本。統計分析兩種方法的差異。 2 結 果 2.1 甲基化-actin基因片段重組質粒的構建 甲基化-actin基因進行常規PCR擴增，產物電泳得到一個大約133 bp 左右的電泳條帶，即為目的條帶(圖1)。構建的ACTB重組質粒的測序結果顯示插入片段與預期片段序列完全一致。 Fig 1 both lane 1 and lane 2 show the DNA fragme

19、nts amplified by the MACTB primers, and the length is 133bp. Marker: Fermentas SM 0201 (MBI) 圖1 1，2均為MACTB的引物擴增出來的長度133個bp的片段。Marker：fermentas SM 0201。 2.2 SYBR Green I FQ-PCR反應條件的確定： 通過多次試驗，得到下述最佳反應體系：總體積為25L，Mg2 +濃度4mmol/ L，引物濃度0.2mol/L，dNTPs濃度0.2mol/L，Fermentas Taq DNA聚合酶1U。反應采用三步法：94 4 min； 94 1

20、5 s； 60 25s；72 30s共40個循環。 Figure 2 Amplification curve of standard plasmid of MACTB by using SYBR Green I dye. A: From left to right, the quantities of standard plasmid are from 7.8×109 to 7.8×104 copies/ml. B: Figure of standard curve, relation ratio R2 is 0.996. C: Figure of Dissociation

21、 curve, the dissociation temperature of objective DNA fragment is 79.1 圖2 A: SYBR Green I 熒光定量PCR對稀釋的標準質粒檢測所形成的擴增曲線，從左至右分別為7.8×1097.8×104拷貝/ml。B：標準曲線圖，R2為0.996。C：融解曲線圖，目的產物的融解溫度為79.1 2.4靈敏度試驗 在最佳條件下多次檢測后，確定本實驗中SYBR Green I 熒光定量PCR的最小的檢測限為78拷貝。 2.5 重復性試驗 6次FQ-PCR反應(每次反應各3管)標準質粒109104 拷貝/l的C

22、t均值分別為13.84、17.72、21.18、24.61、28.17、31.24，變異系數分別為2.97%、2.29%、3.74%、3.47%、3.31%、3.63%。3次試驗各稀釋點的平均Ct值分別為13.62、17.56、21.28、24.03、28.15、30.16，平均試驗間變異系數為3. 28%。 2.6 特異性測定 未修飾的正常DNA以及沒有模板的陰性對照擴增結果均顯示為陰性，從融解曲線可見有引物二聚體的形成，而沒有目的擴增產物。作為陽性對照的經過亞硫酸氫鈉修飾的正常基因組的DNA及見有特異產物的擴增，Ct值較陰性對照小，融解曲線在79即見特異性的峰，見圖3。 2.3 SYBR

23、Green I 定量標準曲線的建立 抽提的重組質粒測定吸光度值為0.778，拷貝數為：7.8×1013拷貝/ml。倍比稀釋成1012 102 拷貝/ml，在最佳反應條件下進行定量擴增，統計學分析顯示不同濃度的標準品的ct值與該標準質粒的對數成線性關系，起始模板為109104 拷貝/ml時線性較好，R2為0.996。經過融解曲線測定，顯示特異性產物的Tm值為79，而引物二聚體的峰則在73。圖2示起始模板為109104 拷貝/ml的動力曲線，循環閾值與模板濃度之間的標準曲線以及融解曲線。 Figure 3 Amplification curve of diluted standard p

24、lasmid of MACTB by using ABI SYBR Green I Master Mix. A: From left to right, the quantities of plasmid are from 7.8×109 to 7.8×104 copies/ml; B: Figure of standard curve, the relation ratio R2 is 0.998; C: Figure of dissociation curve, objective DNA fragment peak can be seen at 79.1, while

25、 the peak of primer dimer is at 73 圖3 A：ABI的SYBR Green I Master Mix稀釋的標準質粒的擴增曲線，從左至右為7.8×1097.8×104拷貝/ml；B：標準曲線圖，R2為0.998；C:融解曲線圖，目的產物的融解曲線峰在79.1，引物二聚體的峰為73 2.7 SYBR Green I Master Mix試劑盒檢測稀釋的標準質粒 在該反應條件下能夠將105拷貝/ml與104拷貝/ml區別開來，即檢測下限為78個拷貝。該法所檢測的曲線，R2為0.998，線性要比本試驗中構建的方法略好（圖4）。 Figure 4 A

26、: Amplification curves of positive and negative controls in specific test. We can see that negative control did not amplify and was a straight line. As for the positive control, from left to right, they are two standard MACTB plasmids and sodium bisulfite modified normal genome DNA respectively. B:

27、Figure of dissociation curve. Dissociation temperature of objective DNA production is 79.1, and the negative control show nothing amplified but a straight line 圖4 A：特異性實驗中的陽性和陰性對照的擴增曲線，陰性對照在圖中顯示為一條直線，未見擴增。而從左至右的曲線為陽性對照的標準ACTB質粒兩個和修飾的正常基因組DNA；B：對應的融解曲線圖，可見79.1附近目的產物的融解峰。陰性對照則顯示為一條直線 2.8 TaqMan熒光定量PCR

28、對標準質粒的測定 將梯度稀釋的ACTB標準質粒用探針法進行檢測。摸索條件后的體系為：總體積為25L，Mg2 +濃度4mmol/L，引物濃度0.2mol/L，探針濃度0.2mol/L，dNTPs濃度5mol/L，Fermentas Taq DNA聚合酶1U。反應采用二步法：94 4 min； 94 30 s； 60 45s共40個循環。檢測結果顯示，該方法的靈敏度為78個拷貝。線性范圍為1010104拷貝/ml，R2為0.998，如圖5示。 Figure 5 A: diluted standard plasmid amplification curve, from left to right,

29、the quantities of plasmid are from 7.8×109 to 7.8×104 copies/ml. B: standard curve according to A, relation ratio R2 is 0.9981 圖5 A：Methylight檢測稀釋標準質粒的擴增曲線圖，從左至右分別7.8×1097.8×104拷貝/ml。B：對應A圖的標準曲線圖，R2為0.9981 2.9 普通甲基化PCR檢測甲基化-actin基因標準品質粒 在7 ×106 7 ×109拷貝稀釋度范圍內均有133 bp特異性

30、條帶出現，但除了7 ×106 拷貝擴增的條帶亮度較弱外，其余條帶亮度沒有特異性差異；在7 ×1027 ×105 拷貝4個稀釋度水平沒有檢測到特異性條帶(圖6) 。 ure 6 M: Marker, Lane 0 and 1 are negative control. From lane 2 to 9, they are the diluted standard plasmid, 7.8×102 to 7.8×109copies/ml 圖6 M：Marker，0，1均為陰性對照，29分別為稀釋的ACTB質粒，7.8×1027.8

31、5;109拷貝/ml。 2.10 對比實驗 分別用本實驗中的SYBR Green I方法、TaqMan法對31例肝癌和14例正常標本進行檢測。3次檢測的Ct均值統計結果見表1。經隨機配對t檢驗得到，t-0.78，0.43 討 論 DNA甲基化模式的改變在腫瘤發生中的作用被越來越多的研究者認可，該領域的研究更成為腫瘤研究的熱點。 目前檢測甲基化的方法中，MSP方法的靈敏度可以達到大多數實驗室研究的要求，但是需要后續的電泳和成像過程，難以實現自動化。新的TaqMan熒光定量PCR方法，即Methylight，通過特異性探針的應用能夠準確地定量DNA甲基化，有較高的靈敏度和特異度。但需要合成特定的探

32、針，價格昂貴。 本實驗中所建立的SYBR Green I 實時熒光定量PCR法，利用熒光染料與dsDNA的結合而發出熒光，繼而確定初始模板的量11。此法既不受酶切位點的限制，也無需合成特異的探針，可以直接由普通PCR改為定量PCR，省略了后續的電泳和成像過程。但因其定量原理的緣故，其除與特異性產物雙鏈結合外，尚可以與其他非特異的產物結合，特別是引物二聚體，而使其定量的靈敏度和特異度受到影響。但定量儀器在這種染料法的檢測過程中可以制作融解曲線，通過區分產物的融解峰溫度而區分特異與非特異的產物12。同時，引物以及模板的量也都是在經過多次實驗后確定的最佳反應量，引物二聚體以及其他非特異性擴增的量降到

33、最低水平。SYBR Green I定量方法尚可使用熱啟動酶和UNG酶以提高其特異性。熱啟動酶在擴增反應開始之前，酶的活性很低，形成雙鏈結構的概率很小。UNG酶則可在PCR擴增之前將形成的含有U的DNA雙鏈降解，繼而使反應的靈敏度增加13。本試驗中，直接用SYBR Green I熒光染料定量檢測DNA甲基化，未加入UNG酶和熱啟動酶，靈敏度為78拷貝，特異度較好，線性范圍寬。作為SYBR Green I 熒光定量方法的標準對照，ABI公司的SYBR Green I Master Mix試劑盒加入了上述兩種酶，同時加入了參比熒光ROX。參比熒光校正使實驗結果受初始熒光的影響較小。試驗結果顯示其檢測

34、靈敏度為78拷貝，同本實驗所建立的定量方法相同，僅曲線的擴增效率較本實驗方法好，R2為0.998。從融解曲線可以看到只在79的位置有尖銳的峰出現，電泳證實為特異性的產物。 45例經亞硫酸氫鈉修飾后的肝組織標本分別用Mehtylight和本實驗中的SYBR Green I熒光定量方法檢測，所得平均Ct值用配對t檢驗進行統計分析后，發現兩種方法沒有差異，即統計學上可以認為SYBR Green I的效果可以達到Methylight的檢測水平。進一步優化此方法，將來可將其應用于腫瘤特定基因CpG島的異常甲基化的檢測中。 本試驗成功構建了甲基化-actin基因的標準品質粒，并在此基礎上建立了SYBR G

35、reen I 熒光定量PCR檢測DNA甲基化的標準曲線，線性范圍從109104拷貝/ml，曲線的R2為0.996。檢測的靈敏度為78拷貝，與Methylight方法相同。對比分析顯示該兩種方法檢測效果差異無統計學意義，結果相一致。故SYBR Green I 熒光定量PCR法可以用來檢測DNA甲基化，靈敏度與特異度高，重復性好，可以高通量、準確檢測，并且成本低廉，操作簡單，適用于大量臨床標本的檢測。 參考文獻 1 Momparler RL, Cancer epigenetics, Oncogene 2003, 22:6479-6483. 2 Lee MP, Genome-wide analysi

36、s of epigenetics in cancer, Ann N Y Acad Sci 2003, 983:101-109. 3 Qiu G, Fang J, He Y, 5' CpG island methylation analysis identifies the MAGE-A1 and MAGE-A3 genes as potential markers of HCC. Clin Biochem. 2006 Mar;39(3):259-66. 4 Feinberg AP, Ohlsson R, Henikoff S, The epigenetic progenitor ori

37、gin of human cancer, Nat Rev Genet, 2006 Jan;7(1):21-33. Review 5 Gerda Egger, Gangning Liang, Ana Aparicio, etal Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy Nature 429, 27 May 2004,457-463. Insight. 6 Susan E. Cottrell, Molecular diagnostic applications of DNA methylation tech

38、nology, Clinical Biochemistry 37 (2004) 595 604. 7 Herman JG, Graff JR, Myohanen S, etal, Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 98219826 (1996). 8 Ivan BIECHE1, Martine OLIVI, Marie-He´lene CHAMPEME, etal Novel approach to quantitative polymerase chai