1、蒲黃總黃酮抑制棕櫚酸培養(yǎng)下C2C12骨骼肌細(xì)胞白細(xì)胞介素6的表達(dá)         09-08-13 16:46:00     編輯：studa20                 作者：婁少穎, 劉毅, 陳偉華, 應(yīng)健, 何燕銘, 王文健【摘要】  目的：觀察蒲黃總黃酮（Pollen Typhae

2、total flavones，PTF）對棕櫚酸培養(yǎng)下C2C12骨骼肌細(xì)胞白細(xì)胞介素6（interleukin6, IL6）表達(dá)的影響，探討PTF改善骨骼肌胰島素抵抗（insulin resistance, IR）的可能機(jī)制。方法：0.25 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)建立骨骼肌細(xì)胞IR模型。根據(jù)處理方法不同，設(shè)對照組、模型組、核轉(zhuǎn)錄因子B（nuclear factorkappaB, NFB）抑制劑PDTC組、羅格列酮（rosiglitazone, ROS）組、ROSPDTC組、PTF組和PTFPDTC抑制劑組。處理16 h后，3H脫氧葡萄糖攝入法觀察細(xì)胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率，實時定量多聚酶聯(lián)反應(yīng)檢測IL

3、6 mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL6蛋白水平。結(jié)果：0.25 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)16 h，C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取率下降30.43%，IR模型建立；PTF可使IR模型細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率增加32.39%，IL6 mRNA表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL6蛋白水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加入PDTC后，細(xì)胞IL6 mRNA表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL6蛋白水平上升（P<0.05）。結(jié)論：PTF通過抑制NFB通路而抑制C2C12骨骼肌細(xì)胞IL6 mRNA表達(dá)及蛋白分泌，可能是其減輕骨骼肌炎癥狀態(tài)和改善IR的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  蒲黃

4、總黃酮; 棕櫚酸; 胰島素抵抗; 白細(xì)胞介素6; C2C12細(xì)胞株Objective: To observe the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on expression of interleukin6 (IL6) mRNA and protein secretion in C2C12 cell strain of skeletal muscle cells cultured with palmitate, and to explore the mechanism of PTF in relieving insulin resi

5、stance (IR).Methods: The IR of C2C12 cells was induced by coculturing with palmitate. The C2C12 cells were divided into normal control group, untreated group, PDTC (a nuclear factorkappaB inhibitor) treated group, rosiglitazone (ROS)treated group, ROS+ PDTC treated group, PTFtreated group and PTF+PD

6、TCtreated group. Sixteen hours after culture, the transportation rate of glucose was observed by 3Hdeoxyglucose uptake method; IL6 mRNA expression in C2C12 cells was assayed by real time polymerase chain reaction (Realtime PCR), and level of IL6 protein secretion in culture supernatant was detected

7、by enzyme linked immunosorbent assay.Results: Compared with the normal control group, the transportation rate of glucose of cells in untreated group was decreased 30.43% after 16hour palmitate culture, and was increased 32.39% in the PTFtreated group. Compared with the untreated group, the levels of

8、 IL6 mRNA expression in cells and IL6 protein secretion in supernatant were significantly decreased in the PTFtreated group (P<0.05). The levels of IL6 mRNA expression in cells and IL6 protein secretion in supernatant were increased in PTF+PDTCtreated group as compared with PFTtreated group (P<

9、;0.05).Conclusion: PTF can inhibit the IL6 mRNA expression and IL6 protein secretion via nuclear factorkappaB pathway in C2C12 skeletal muscle cells, which may be one of its mechanisms in relieving inflammation conditions and insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells.Keywords: Pollen Typhae

10、total flavones; palmitate; insulin resistance; interleukin6; C2C12 cell strain脂質(zhì)在骨骼肌中蓄積是引起骨骼肌胰島素抵抗（insulin resistance, IR）的重要原因1。近年來越來越多的證據(jù)表明炎癥與骨骼肌IR關(guān)系密切2。脂質(zhì)蓄積導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子B（nuclear factorkappaB, NFB）途徑被激活，使白細(xì)胞介素6（interleukin6, IL6）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factoralpha, TNF）和IL1等相關(guān)細(xì)胞因子顯著增加3, 4。中醫(yī)藥在改善炎癥狀態(tài)和骨骼肌

11、IR等方面有較好的療效。本研究通過觀察蒲黃的主要成分蒲黃總黃酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）對棕櫚酸誘導(dǎo)的處于IR狀態(tài)的C2C12骨骼肌細(xì)胞IL6的影響，探討PTF改善骨骼肌IR的可能機(jī)制。1  材料與方法1.1  細(xì)胞培養(yǎng)和分化  小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞株購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC），用含10小牛血清的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）培養(yǎng)，每3 d傳代1次。于90細(xì)胞融合時換

12、用含2馬血清的DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，2 d換液1次，誘導(dǎo)分化47 d，待95細(xì)胞被誘導(dǎo)分化出現(xiàn)肌管時用于實驗5。1.2  藥物與試劑  PTF由上海信誼藥業(yè)有限公司提供。棕櫚酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）由Sigma公司提供，羅格列酮（rosiglitazone, ROS，分子量473.52）粉劑由浙江天馬制藥有限公司提供；IL6酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒由RD公司提供；3H脫氧葡萄糖由北京原子高科有限公司提供；TRIzol試劑由美國I

13、nvitrogen公司提供；BIO RAD Icycler 5色熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）儀、Icycler version3.1.7050熒光定量分析軟件均由BIO RAD公司提供。1.3  實驗藥品配制  PTF的配制：取PTF 16 mg加入2 ml ddH2O中，溶解后配成8 g/L的原液，0.22 m過濾器抽濾除菌；ROS的配制：取ROS 47.352 mg加入5 ml DMSO中，溶解后配成2×104 mol/L的原液，0.22 m過濾器抽濾除菌。20 儲存?zhèn)溆茫R用前稀釋。1.4 

14、 細(xì)胞分組和干預(yù)  在6孔或12孔板中培養(yǎng)和分化骨骼肌細(xì)胞，待細(xì)胞分化成熟之后，分組如下：正常對照組、模型組、模型PDTC（5 mmol/L）組、PTF組、PTFPDTC組、ROS組和ROSPDTC組。正常對照組含1牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的DMEM培養(yǎng)，模型組細(xì)胞予含0.25 mmol/L棕櫚酸和1 BSA的DMEM培養(yǎng)，在模型組基礎(chǔ)上，PTF組加入0.5 g/L PTF，ROS組加入5 mol/L ROS，PDTC組加入PDTC，PTFPDTC組和ROSPDTC組分別再加入2種相應(yīng)藥物，干預(yù)16 h。16 h后檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率，轉(zhuǎn)運(yùn)率下降

15、率有統(tǒng)計學(xué)意義，提示IR模型建立成功5，可供實驗用。1.5  葡萄糖攝取實驗  IR模型細(xì)胞接種于24孔板，以克林二氏磷酸鹽緩沖液（KrebsRinger phosphate buffer, KRPB）沖洗3次，再以含1 nmol/L胰島素的KRPB洗3次，再以含100 nmol/L胰島素的KRPB 37 孵育30 min； 加入1 ml含0.5 Ci/m1 3H脫氧葡萄糖，37 孵育20 min，以冰預(yù)冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速沖洗3次中止反應(yīng)。加入1 ml 0.1 mol/L氫氧化鈉作用2 h，取細(xì)胞裂解液，液閃計數(shù)其每分鐘衰變數(shù)6。1.6 

16、實時定量PCR檢測IL6 mRNA表達(dá)  （1）各組細(xì)胞藥物干預(yù)16 h，吸去上清，分別收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書方法提取細(xì)胞總RNA，以紫外分光光度計260 nm和280 nm波長測定RNA吸光度(absorbance, A)，用A260/A280比值確定RNA濃度；然后每個樣本取2 g RNA，在RNA酶抑制劑以及反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)作用下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，20 保存?zhèn)溆谩＃?）IL6 上游引物：5CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG TT3，解鏈溫度（melting temperature, Tm）58 ；下游引物：5GAA GTA GG

17、G AAG GCC GTG G3， Tm 59 ；探針：fam5CCT TCT TGG GAC TGA TGC TGG TGA CA3tamara，Tm 69 。內(nèi)參甘油醛3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5GAC AAC TTT GGT ATC GTG GAA GG3，Tm 60 ；下游引物：5CCA GTA GAG GCA GGG ATG ATG T3， Tm 60 ；探針：fam5CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT3tamara，Tm 70 。IL6擴(kuò)增長度70 bp，內(nèi)

18、參GAPDH擴(kuò)增長度140 bp；IL6及內(nèi)參的引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。（3）熒光定量反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：預(yù)混合的PCR反應(yīng)液（熒光定量Master MIX）27.5 l，上、下游引物各0.6 l，探針0.3 l，模板（100 ng）1 l。擴(kuò)增條件：95 3 min，95 20 s，60 20 s，擴(kuò)增50個循環(huán)。（4）繪制曲線和分析結(jié)果：根據(jù)各樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖，采用BIO RAD公司的Icycler Version 3.1.7050熒光定量分析軟件，分析PCR過程中各檢測樣本的CT（cycle threshold）值。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線

19、，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值，根據(jù)未知樣品的CT值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。1.7  ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL6蛋白濃度  準(zhǔn)備好洗滌緩沖液和IL6標(biāo)準(zhǔn)品，所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份重復(fù)；將100 l標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，加入包被抗體的微孔板合適位置的微孔內(nèi)；50 l生物素標(biāo)記的抗IL6抗體加入包被抗體的微孔板的微孔內(nèi)，輕搖板架，混勻，加蓋，37 孵育120 min；洗滌微孔板；在每孔內(nèi)加入100 l酶結(jié)合物，輕敲微孔板，使內(nèi)容物充分混合，加蓋，37 孵育60 min；在第2次孵育結(jié)束前15 min之內(nèi)與底物溶液混合；按照上述方法重復(fù)洗板；在

20、每孔內(nèi)加底物100 l，加蓋，37 下孵育15 min；在每孔內(nèi)加終止液100 l，輕敲微孔板，使內(nèi)容物充分混合；在30 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測出光密度（optical density, OD）值。然后根據(jù)IL6標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（ng/L）和其在450 nm處的OD值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各樣品的OD值分別計算出相應(yīng)的樣品濃度。1.8  統(tǒng)計學(xué)方法  采用Stata 7.0軟件統(tǒng)計包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用檢驗，計數(shù)資料采用檢驗。2  結(jié)果2.1  PTF對IR模型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響  0.25 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞16 h，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率明顯下降，為正常對照組的69.57%（P<0.05），根據(jù)Reaven等7提出的IR經(jīng)典定義，并參考文獻(xiàn)5，我們認(rèn)為骨骼肌細(xì)胞IR模型建立成功。PTF組C2C12細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為模型組的132.39%，ROS組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為模型組的145.88，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；PTF組與ROS組細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義