1、第34卷第3期Vol.34No.3南華大學學報 醫學版乙型肝炎病毒X基因真核表達載體的構建及表達王 靜,蔣永林,李金麗,蔡恒玲,萬艷平(南華大學病原生物學研究所,湖南衡陽421001)TM(+)-HBx。用梭華-Sofast基因轉染試劑將其質粒轉染THP-1巨噬細胞,細胞裂解液經SDS-PAGE及轉硝酸纖維素膜后做Westernblotting,鑒定目的蛋白。結果 雙酶切pcDNA3.1(+)-HBx后,瓊脂糖電泳可分別見到大小約為5.4kb和465bp片斷,說明X亞克隆入pcDNA3.1(+),經序列測定其含有完整的X基因片段;Westernblotting結果顯示pcDNA3.1(+)-H

2、Bx能在THP-1巨噬細胞中表達X蛋白。結論 成功構建了真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx,并能在THP-1巨噬細胞中表達X蛋白。關鍵詞:乙肝病毒(HBV); X基因; X蛋白; 真核表達中圖分類號:R373.21 文獻標識碼:A 文章編號:1672-7444(2006)03-0320-04ConstructionandExpressionofEukaryoticVectorforHBVXWANGJing,JINGYong-lin,LIJin-li,etal(InstituteofPathogenicBiology,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan4210

3、01,China)Abstract:Objective ThisstudywasdesignedtoconstructandexpresstheeukaryoticexpressionvectorofHBVXgeneforexploringthecontributionofXgenetothechronichepatitisandthehepatocellular. Methods XgenewithEcoR andHind endoenzymesiteswasobtainedbyusingPCR,andsubclonedintopcDNA3.1(+)vector.Afteridentifie

4、dbyrestrictiveenzymesdigestionandsequencing,reconstructedplasmidwastransfectedintoTHP-1cells.ExpressionofXwereassayedinTHP-1celllysatebyWestern-blotting. Results ThetargetgeneXfragmentabout465bpwasobtained.InTHP-1cell,thepcDNA3.1(+)-HBxplasmidexpressedXpro-teinwithmolecularweightof17kDabyWestern-blo

5、tting. Conclusion EukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)-HBxwasconstructedsuccessfullyandXproteinwasexpressedinTHP-1cell.KeyWords: HBV; Xgene; Xprotein; eukaryoticexpression.人類乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科,能引起急、慢性肝炎(acute,chronichepatitis)、肝硬化(cirrhosis)和肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)1,2有4

6、個開放閱讀框(openreadingframe,ORF),包括包膜基因編碼區(含pre-s1,pre-s2和s基因編碼區),pc基因和c基因編碼區,p基因編碼區,x基因編碼區1,3。HBVDNA具。其中HBx基因是HBVDNA中基金項目:湖南省衛生廳資助課題(編號:B2005084).通訊作者:萬艷平,教授,碩士生導師,E-mail:YanpingWan.最小的一個,編碼基因位于13741838核苷酸之間,全長465bp,它所編碼的X蛋白由154個氨基酸組成。HBx基因是HBV復制和擴散所必需的基因,在乙肝慢性化和HCC的發生中具有重要作用。實驗證實X蛋白是一種反式激活因子,其本身不能與雙鏈D

7、NA直接結合,而是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來行使功能,可以通過參與不同的信號傳導通路,在細胞的分裂增殖、細胞凋亡、乙型肝炎慢性化和腫瘤發生等方面發揮不同4,5的作用。為了進一步研究X基因的生物學功能、分子生物學特性以及乙肝病毒感染后的細胞免疫,作者構建了HBVX基因的真核表達載體,并在體外培養的真核細胞中進行表達。CTGTG-3 ;引物2:5 -CGCTTAGGCAGAGGGGAAA-3 。在25 L反應體系中加入2.5 L10 反應緩沖液,0.5 L1mmol LdNTP,HBVDNA模板1.0 L,兩引物各0.5 L,Taq酶0.2 L,MgCl21.8 L,補水至25 L。反應條件為

8、:94 預變性5min;94 60s,60 60s,72 60s,35個循環;72 終延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。膠回收試劑盒回收PCR產物。(3)載體pcDNA3.1(+)-HBx構建:將PCR產物與質粒pcDNA3.1(+)用EcoR 和Hind 雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳,回收約500bp目的基因片段與5.4kb的pcDNA3.1(+)質粒片段,用T4連接酶連接,構建載體pcDNA3.1(+)-HBx,轉化感受態細胞DH5 ,選取氨芐抗性克隆并用質粒提取試劑盒提取質粒,經EcoR 和Hind 雙酶切后,用瓊脂糖凝膠電泳證實含有目的基因片段,并將陽性克隆進行DNA測序。1.2.2 重

9、組質粒的瞬時表達及鑒定 (1)細胞培養:THP-1細胞用RPMI164010%小牛血清,于37 、5%CO2條件下培養,轉染前24h加入佛波酯(PMA),使其終濃度為25ng mL,誘導其分化為巨噬細胞,再進行轉染,轉染時細胞分布應占平皿的50%80%。(2)細胞轉染:按梭華-Sofast基因轉染試劑說明書將質粒pcDNA3.1(+)-HBx轉染THP-1巨噬細胞,同時作pcDNA3.1(+)及空白對照組。(3)Westernblotting鑒定:轉染后48h收獲細胞并裂解細胞內總蛋白,取20 L處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉移至NC膜,5g L脫脂奶封閉1h,加入1 2000

10、稀釋后的一抗孵育1h,PBST洗膜,然后與1 4000二抗孵育1h,PBST洗膜后加入發光底物孵育1min,暗室中用X光片曝光、顯影、定影。TM1 材料與方法1.1 材料 乙肝病人血清由南華大學第一附屬醫院傳染科提供。pcDNA3.1(+)質粒和DH5 由本室保存,THP-1細胞由南華大學心血管研究所惠贈。dNTP、Taq酶、T4連接酶、EcoR 、Hind 、100bpDNAMarker購自上海生物工程公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于華美生物工程公司。鼠抗人HBVX一抗、佛波酯(PMA)購于晶美生物工程公司,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗購于博士德公司。Westernbl

11、otting所用發光底物購于Amersham公司。梭華-Sofast基因轉染試劑購于廈門太陽馬生物工程有限公司,RPMI1640購于Gibco公司,引物合成由上海生物工程公司提供。1.2 方法1.2.1 X基因真核載體的構建 (1)血清HBVDNA抽提:100 L血清加入300 LTES液(10mmol LTris-HCl,pH8.0,5mmol LEDTA,0.5%SDS,50 gProteaseK)混勻,60 消化1h,等體積苯酚 氯仿及氯仿抽提各一次,上清加入2倍體積無水乙醇及1 10體積3mol L醋酸鈉(pH4.8)沉淀病毒DNA,再以70%乙醇漂洗一次,并溶于20 L滅菌雙蒸水中。

12、(2)PCR擴增X基因:根據網上數據庫公布的HBVX序列(PubmedNC_003977),設計引物,分別在上游引物和下游引物5 端添加限制性內切酶EcoR 和Hind 酶切位點。引物1:5 -GTTAAGCTTATGGCTGCTAGGTM2 結 果2.1 X基因真核載體的構建2.1.1 PCR擴增X基因 進行PCR擴增后,瓊脂糖電泳顯示約500bp處可見一明顯條帶,見圖1。2.1.2 HBx基因表達載體pcDNA3.1(+)-HBx的雙酶切鑒定 重組質粒pcDNA3.1(+)-HBx經Hind 、EcoRI雙酶切,可以切出2個片段,大片段遷移率與pcDNA3.1(+)空質粒遷移率的遷移率接近

13、,小片段位于核酸標準分子量約500bp處,與目的基因大小一致,見圖2。測序結果表明,重組質粒pcDNA3.1(+)-HBx含有完整的正確的X基因片段。圖1 PCR擴增產物瓊脂糖電泳結果Marker上。每年因HBV感染致死的人數有100萬左右。HBVX基因編碼的X蛋白具有多種生物學功能,如反式激活作用,可激活多種病毒和細胞基因,包括RAS、NF- B、FasL、STAT-3及MAKP JAK途徑等,在HCC的發病過程中起核心作用6,71;或通過影響正常的細胞周期,干擾DNA的8修復及調節肝細胞增殖、分化和凋亡等。另外,Lee等發現HBx可直接與轉化生長因子 (trans-forminggrowt

14、hfactorbeta,TGF- )信號轉導通路上的蛋白質Smad4發生相互作用,促進其核轉位,后者同AP-1轉錄因子活化蛋白-1(activator圖2 pcDNA3.1(+)-X的雙酶切protein,AP-1)、ATF2、TFE3等協同作用后可以調節靶基因轉錄,增強TNF的信號轉導,這部分說明X蛋白可以影響宿主的免疫功能。本實驗成功構建了X基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx,利用載體上無組織特異性的啟動子CMV指導HBx的表達,為進一步研究HBx對宿主的免疫功能奠定了前期實驗基礎。由于乙肝病毒感染的宿主專一性很強,只感染人及少數幾種靈長類動物,因此,大大限制了人類對這類病毒

15、性疾病的研究和防治。利用現代分子生物學技術,能將感興趣的基因轉染到細胞中穩定、持續地表達,在體外細胞水平上了解X基因的表達調控,并分析其表達產物的生物學功能。pcDNA3.1(+)是一常用的哺乳動物細胞表達載體,載體上巨細胞瘤病毒(CMV)是一表達效率較高的啟動子,帶有原核和真核復制起始序列,以及抗氨芐青霉素(AmpR)和新霉素(NeoR)抗性基因篩選標志和一系列在哺乳動物細胞所需的表達調控元件。文獻中研究HBx所用的細胞株大多是2.2 真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx在THP-1巨噬細胞中的表達 將pcDNA3.1(+)-HBx和pcDNA3.1(+)分別瞬時轉染THP-1巨噬細胞

16、,轉染后48h用鼠抗人HBVX一抗做Westernblotting分析,pcDNA3.1(+)-HBx轉染組在17kDa處出現了陽性反應帶,而在pcDNA3.1(+)轉染組與THP-1巨噬細胞對照組相應泳道則沒有陽性反應帶,見圖3。表明所構建的真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx可以在真核細胞內正確表達。3 討 論乙型肝炎是嚴重威脅人類健康的世界性傳染病。據WHO報道,世界上已有20億人被乙型肝HepG2、HLF、CCL213細胞以及小鼠成纖維細胞(NIH3T3)和原代成纖維細胞等,至今未見X基因轉染THP-1巨噬細胞,本實驗將pcDNA3.1(+)-HBx轉染THP-1巨噬細胞并進行表

17、達,下一步作者將探索HBVX蛋白在肝癌發生中的致病作用及其分子機制。參考文獻:1 ArbuthnotP,KewM.HepatitisBvirusandhepatocellularcarcino-maJ.IntJExpPathol,2001,82(2):77-100.andhepatitisBvirus:aprospectivestudyof22707meninTaiwanJ.Lancet,1981,2:1129-1133.3 ChisariFV.Viruses,immunityandcancer:lessonsfromhepatitisBJ.AmJPathol,2000,156:1117-11

18、32.acofactorofsurvivininapoptosissuppressionJ.EMBOJ,2003,22(11):2729-2740.ofenhancerIandXpromoterinhepatitisBvirusmoreefficientlythanp73alphaJ.WorldJGastroenterol,2002,8(6):1094-1097.hepatocellularcarcinomaanditsrelationshipwithFas FasLsystemJ.WorldJGastroenterol,2003,9(12):2671-2675.inhibitsFas-med

19、iatedapoptosisandisassociatedwithup-regu-lationoftheSAPK JNKpathwayJ.JBiolChem,2001,276(11):8328-8340.8 LeeDK,ParkSH,YiY,etal.ThehepatitisBvirusencodedon-co-proteinpXamplifiesTGF- familysignalingthroughdirectinteractionwithSmad4:potentialmechanismofhepatitisBvirus-inducedliverfibrosisJ.GenesDev,2001

20、,15(4):455-466.(收稿日期:2006-04-23)(上接第319頁)1激。但姜黃素對心血管系統的作用主要集中在降脂724參考文獻:1 NaitoM,WuX,NomuraH,etal.Theprotectiveeffectsoftetra-hydrocurcuminonoxidativestressincholesterol-fedrabbitsJ.JAtherosclerThromb,2002,9(5):243-250.extractsupplementationreducesoxidativestressandattenuatesaort-icfattystreakdevelo

21、pmentinrabbitsJ.ArteriosclerThrombVascBiol,2002,22(7):1225-1231.3 ZhangW,LiuD,WoX,etal.Effectsofcurcumalongaonprolif-erationofculturedbovinesmoothmusclecellsandonexpressionoflowdensitylipoproteinreceptorincellsJ.ChinMedJ(Engl),1999,112(4):308-311.4 Ramirez-TortosaMC,MesaMD,AguileraMC,etal.Oralad-ministrationofaturmericextractinhibitsLDLoxidationandhashy-pocholesterolemiceffectsinrabbitswithexperimentalatherosclerosisJ.Atherosclerosis,1999,147(2):371-378.5 QuilesJL,AguileraC,MesaMD,etal.Anethanolicaqueousex-tractofcurcumalongadecreasesthesusceptibilityoflivermicr