1、液體樣品RNA提取試劑 RNAtrip LS貨號：M090158描述：RNAtrip LS是RNAtrip和TRIzol的增強版本，在有效提取固體組織和細胞RNA的同時，特別加強了對液體標本如全血、懸浮細胞、病毒樣品等RNA的提取能力。用RNAtrip LS試劑提取液體標本RNA時，無需事先分離其中的細胞、細菌、病毒等病原微生物，直接將液體標本與RNAtrip LS試劑混合即可，這樣就極大簡化了樣品的提取前處理過程。并且其提取能力強大，甚至可以從已經(jīng)凝固的血液塊中提取出高純度的RNA。使用方法與RNAtrip LS和TRIzol相似，可在3060分鐘內(nèi)完成。獲得高純度總RNA可用于RT-PCR

2、、Northern Blot、RNA酶保護、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實驗。血液RNA提取試劑具有與RNAtrip LS相似的特征，可以使用同一說明書。儲存：4 oC密封避光保存一年以上有效。適用： (1) 液體標本(200 µl/ml): 全血、體液、尿液，懸浮細胞、病毒微生物樣品等。(2) 培養(yǎng)細胞 (5-10 x 106細胞/ml): 真核細胞，細菌，酵母。(3) 固體組織 (50-100 mg/ml ): 人、動物、植物的各種新鮮或凍存組織。操作準備：極微量的RNA酶都會導致RNA降解。RNA酶污染主要來自以下五個方面：(1) 來自實驗人員的雙手。(2) 來自器

3、皿、吸頭離心管、自備液體。(3) 組織細胞破碎不可避免地釋放內(nèi)源RNA酶。(4) RNA未能完全與蛋白質(zhì)分離。(5) RNA沉淀和溶解時來自吸頭離心管和溶液。我們的Step by Step質(zhì)量監(jiān)測表明，RNAtrip LS試劑可100抑制內(nèi)源性和實驗用品引入的外源RNA酶污染，并在隨后的分離步驟極為有效地清除蛋白包括RNA酶。因此在有RNAtrip LS存在的情況下高壓消毒30分鐘的吸頭離心管和溶液，可以勝任RNA提取操作。然而，一旦離開RNAtrip LS試劑的保護，如在沉淀和溶解步驟，來自吸頭離心管和液體的RNA酶污染可能導致RNA降解。因此在這些步驟應嚴格使用高壓消毒用品。戴手套無疑是有

4、益的，但戴口罩和帽子則無必要。只要嚴格按照本指南進行準備和操作，使用RNAtrip LS試劑總是能獲得完整的高純度總RNA。這里描述的僅是針對RNAtrip LS試劑的實驗準備方案，對其它來源RNA提取試劑未做全面檢查。1. 固體組織破碎設備。準備下列裝置之一，1)玻璃勻漿器。必要時泡酸清潔，用高壓滅菌蒸餾水洗滌數(shù)次。2)研缽。適用于液氮凍存組織的研磨，清洗同玻璃勻漿器。3)組織細胞超聲破碎儀器。探頭插入裝滿蒸餾水的試管或燒杯中，開啟超聲清洗探頭30秒至1分鐘。4)高速機械勻漿器(Polytron，Tekmar或類似產(chǎn)品)。打開開關(guān)，在蒸餾水中清洗分散器頭數(shù)次。對這些裝置的部分部件高壓消毒30

5、分鐘是保險的措施，但使用RNAtrip LS這種處理并不必要。2. 高壓蒸汽30分鐘消毒一次性吸頭離心管。RNA沉淀和溶解之后，應嚴格使用高壓消毒的一次性用品。然而RNAtrip LS能在RNA酶污染環(huán)境下工作，在裂解步驟可使用未高壓但潔凈的一次性吸頭和離心管，但僅推薦在緊急情況下這樣做。由于不可預測的原因，如動物已經(jīng)處死，組織已取出，細胞已收取，而吸頭和離心管尚未高壓處理。這僅適用于RNAtrip LS試劑，對其它來源RNA提取試劑無效。此時保險做法是使用普利萊公司的組織RNA保護液(Cat# R1030)，把來不及處理的標本保存在RNA保護液中，25 oC保存2周，4 oC保存4周，20

6、oC保存數(shù)月，標本中RNA不會降解。3. DEPC處理的雙蒸水。加DEPC到水中至終濃度為0.01% v/v，室溫過夜，高壓消毒30分鐘。用于溶解RNA，配制TE緩沖液和75乙醇。4. 普通雙蒸水。高壓消毒30分鐘，用于沖洗器皿，配制瓊脂糖凝膠和電泳用緩沖液。注意溶液配制后高壓滅菌，但瓊脂糖不能高壓處理。5. 冰盒和濕冰。在冰上進行操作有助于減少RNA降解。6. 異丙醇，氯仿，純乙醇，分析純。75乙醇用高壓消毒的蒸餾水配制。7. 其它用品。電泳槽，雙蒸水沖洗。離心機和加樣器，無需處理。8. 戴手套。注意某些實驗如提取質(zhì)粒DNA使用大量RNA酶，為防污染須特別清洗實驗器具和實驗區(qū)域。RNA提取程

7、序 1. 組織細胞破碎與裂解冰上操作。立即并快速破碎組織至關(guān)重要。組織細胞過量不僅使RNA得率下降，還將導致DNA和蛋白質(zhì)污染。在緊急情況下，如動物已處死，組織已取出，細胞已收取，異地取送標本，用戶尚未做好實驗準備時，推薦用戶把組織細胞儲存在RNA保護液(Cat# R1020)中，標本中的RNA不會降解。(1) 液體標本：全血、體液、尿液，懸浮細胞、病毒微生物樣品等。每200ml液體樣品加1 ml RNAtrip LS，置冰上。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。(2) 培養(yǎng)細胞。貼壁細胞：棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細胞一次。每5-10´106個細胞加1 ml RNAtrip LS試劑

8、，但加入量必須有效地覆蓋瓶皿的細胞表面。一個75 cm2瓶皿的細胞通常需要 2 ml提取液，一個35 cm2瓶皿的細胞需要 1 ml提取液，更小的培養(yǎng)瓶皿可使用更少的提取液，但后續(xù)操作會因體積過小而極為不便。晃動瓶皿或用吸頭吹打使提取液流過并裂解所有細胞。置冰上15分鐘，傾斜瓶皿使粘稠的裂解物聚于一處以便取出。懸浮細胞：低速離心收集細胞，將細胞快速重懸于50-100ml的PBS或去離子水中，每5-10´106細胞加1 ml RNAtrip LS裂解。注意直接裂解未重懸的細胞沉淀，裂解物將十分粘稠而難以分散。細菌酵母：離心收集沉淀，加入50-100ml去離子水重懸細胞。每107細胞加入

9、1-2 ml RNAtrip LS直接裂解。某些細菌和酵母細胞可能需要勻漿破碎。(3) 動物組織。按比例每50-100 mg組織加1 ml RNAtrip LS試劑。用研缽研磨：僅適用于液氮凍存組織。組織放在研缽中研成粉末，加1 ml RNAtrip LS試劑，繼續(xù)研磨至組織完全裂解。用玻璃勻漿器勻漿：加入RNAtrip LS上下手動勻漿組織10-15次。用高速機械勻漿器：將組織放入塑料試管內(nèi)，試管置冰浴燒杯中，加入RNAtrip LS試劑，將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織塊接觸，轉(zhuǎn)速12,000-20,000 rpm，上下移動試管10-20次，直到組織完全打散，無肉眼可見大塊。有些結(jié)締組織難以完

10、全打碎，可以繼續(xù)下一步操作。用超聲儀：需根據(jù)機器型號進行預試驗，選取能有效破碎組織的功率和時間。2. 將組織細胞裂解物轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，置冰上10分鐘。如需暫停操作，裂解物可凍存于70 oC至少一個月。3. 加入體積的氯仿(0.2ml)，充分顛倒混勻，冰上孵育15 分鐘，溶液開始分相。有時分相不明顯，不影響提取。4. 離心12,000g 4 oC 10 分鐘，溶液分為兩相。RNA保留于上層無色透明水相約，下層為有機相，兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細胞類型和多少有關(guān)。小心吸出上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管，但應留1 mm厚水相，以免擾動和吸入下面的碎片和無機相。如吸入無機相和碎片，應將所取水相

11、放回管中并重新離心10分鐘，再吸取水相。這一點至關(guān)重要，違背此原則容易導致RNA降解和DNA污染。5. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于含有上清的新離心管中，充分混勻。冰上孵育10 分鐘綽綽有余。但20 oC 放置一至數(shù)小時，可回收幾乎所有的RNA。如需盡可能多的RNA，或起始組織細胞的量很少，或用戶需要暫停操作時，可以這樣做。用更低的溫度和更長的時間進行沉淀并不必要。6. 離心, 12,000g，4 oC，10分鐘。小心棄上清，管底可見少許黃白色RNA沉淀。如初始組織細胞量少，RNA沉淀用肉眼幾乎難辨，但不影響實驗。7. 洗滌沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，12,000g

12、5分鐘。棄上清，盡量吸去管壁上的液體。乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉RNA沉淀。此時可將RNA沉淀保存在75%乙醇中，4 oC一周或20 oC一年。8. 敞開管口空氣干燥5-10分鐘，RNA沉淀干燥至膠凍狀即可。過分干燥將使RNA難以溶解。用50-100 ml DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。如RNA難溶，可55 oC加熱10分鐘，或反復凍融數(shù)次助溶。RNA溶液可保存于70 oC或液氮中；或加3倍體積乙醇20 oC凍存，用時離心沉淀。9. 測定OD值。計算RNA濃度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA絕少蛋白污染，比值通常在之間均屬正常。OD260/280

13、比值受很多因素影響。起始組織量過大或RNAtrip LS試劑過少，或吸取了有機相或碎片，將使OD260/280比值降低，應預以避免；RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，而用TE或離子強度較高的溶液溶解時該比值較高，但均不影響RNA使用。用戶應該知道，即便是已降解的RNA，該比值也能達到看似完美的左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否的指標。可進行RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性(見說明2)。 說明：1. 每100 mg組織RNA預期得率為：肝脾60100 mg, 腎50 mg, 腦組織10-15 mg, 胎盤2040 mg, 脂肪50 mg。1 x 107個細胞通常得50100 m

14、g。2. 測定OD值，根據(jù)OD260計算RNA濃度。OD260/280比值可初步判斷RNA質(zhì)量，比值在之間均屬正常。起始組織量過大，或吸取了有機相或碎片，將使RNA樣品中蛋白和雜質(zhì)含量高，RNA沉淀乙醇洗滌不充分(步驟8)，均可導致OD260/280比值降低。例如，RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，用TE或離子強度較高的溶液溶解時較高，但均不影響RNA后續(xù)使用。切記即便是已降解的RNA，OD260/280比值也能達到看似完美的左右，因此該比值并非判斷RNA降解與否最佳的指標。判斷RNA質(zhì)量的最佳途徑是進行普通RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性。 3. 檢查RNA完整性。取1 mg RNA樣品進行11.5%普通瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠染色，紫外燈觀察。28S RNA5 kb亮度應該約為18S RNA2 kb的兩倍，有時可見0.3 kb