1、微尺度流動顯示及速度測量李戰華鄭旭中國科學院力學研究所 非線性力學國家重點實驗室（LNM），北京100080摘 要：本文綜述了微尺度流動顯示和速度測量的前沿技術：MicroPIV、Confocal、TIRFM、MTV、QD等，介紹其工作原理、主要技術指標、適用范圍等。通過對各種系統的分析說明觀測微流動需要解決的主要問題，為進行微流動的實驗研究和發展微流動觀測技術提供參考。關 鍵 字：微流動、流動顯示、MicroPIV、Confocal、TIRFM、MTV、QD1. 引言微尺度流動是指特征尺度在0.1mm 1mm之間的流動，通常出現在微機電系統（MEMS），特別是微流控芯片（Microfluid

2、ic）中。例如，DNA檢測使用的毛細管電泳芯片，微分析系統(mTAS)中使用的微分離器、微閥等器件，均由微米尺度的通道組成。微尺度流動的主要特點是：低Re數，表面力作用為主，與Capillary數、Bond數有關，工作液體多為復雜液體等。微尺度流動特性對系統的性能有很大影響，對微流動特性的研究一直受到關注。微流動特性研究的重要手段之一是進行流場觀測。微尺度流動顯示與宏觀流動顯示主要不同是需要提高空間分辨度和利用高亮度探測儀器等。宏觀速度測量儀器的空間分辨率在幾十微米以上：熱膜流速儀的探頭直徑為5mm，長1.25mm，LDV的光斑直徑約2mm，這些儀器無法用于微尺度流動測量。宏觀流動顯示的示蹤粒

3、子直徑>1mm，而微流動中的熒光示蹤粒子直徑在50-500nm。按照Reyleigh散射定律粒子光強與直徑的6次方成比例衰減，因此需要高光學靈敏度探測器。為了實現微尺度流動診斷，必須對宏觀流動顯示方法進行改進，采用新的實驗儀器或手段。目前微流動顯示方法很多，按照所使用的顯微鏡系統分為：倒置熒光顯微鏡、透射顯微鏡系統、共聚焦顯微系統Confocal等。按照選用的入射光種類分為：利用激光光源的Micro-PIV，利用x射線的X-PIV，利用近場隱失波的TIFMR等。按照選用的示蹤粒子分為：熒光粒子法、分子示蹤法和量子點示蹤法等。本文將綜述微尺度流動顯示和速度測量的主要方法：MicroPIV、

4、Confocal、TIRFM、MTV、QD等，介紹其工作原理、主要技術指標、適用范圍等。通過對系統的分析說明觀測微流動的困難和需要解決的主要問題，為進行微流動的實驗研究、觀測微流控器件的流動特性和發展微流動觀測技術提供參考。2. 微觀粒子圖像測速（Micro-PIV）2.1 特點與發展現狀（1） 原理Micro-PIV是將宏觀PIV測量原理應用于微尺度流動的流場測量技術，它在宏觀PIV測量系統中增加了光學顯微鏡（圖1），利用粒子的熒光提取流場信息。（2） 發展現狀著名實驗流體力學家Adrian研究組的Santiago（1998）1首次利用連續激光器、CCD和熒光顯微鏡組成Micro-PIV系統

5、，測量了繞30mm柱體的Hele-Shaw流。實驗中采用的示蹤粒子是直徑為300nm的熒光粒子，吸收光波長532nm，發射光波長560nm。實驗雷諾數Re=3×10-4，流速為50mms-1。Meinhart et al（1999）2利用雙脈沖激光的MicroPIV系統（圖1b），實現了30mm×300mm矩形微管道內的速度觀測，流速達到8 mms-1，速度測量的空間精度達到0.9mm。Stone et al（2002）3利用軟件處理技術使MicroPIV系統在近壁區速度測量的均方根不確定度達到60nm，為流道內表面的非接觸式測量提供了新的方法。國內李戰華研究組（2003）

6、4對連續熒光下MicroPIV的最小測量速度進行了分析，并對30×50mm微管道低Re數流動速度剖面進行了測量。郝彭飛和何楓（2005）5利用Micro-PIV觀測了200mm微槽道的湍流轉捩和結構，發現在微管道中同樣存在湍流流動模式。王旻利和王元（2005）6詳細綜述了Micro-PIV技術近年來的發展，并介紹了他們的實驗測量結果。(a) MicroPIV系統示意圖2(b) 中科院力學所MicroPIV系統照片圖1 MicroPIV系統示意圖和照片2.2 主要技術參數(1) 空間分辨率l 光學分辨率光學儀器形成圖像的清晰程度受光衍射現象限制。根據Rayleigh判據，光學儀器的像分

7、辨率d為： (2)其中為成像光波波長，NA為物鏡數值孔徑，為介質折射率，q鏡口角。對油鏡n為1.516，q約140150°，為630nm，則分辨率d»0.394mm。空間光學分辨率只與光波波長和物鏡的數值孔徑有關，因此X-PIV采用x射線（300nm），相對于650nm光波，空間分辨率可以提高一倍。l 速度場測量分辨率流場圖像由CCD采集后被數字化，速度場的空間分辨率ds可以表示為： (3)其中L為物理平面內的觀測長度、Mw為物鏡放大倍數、N為CCD在觀測長度內的點陣數。當使用100倍物鏡時，視場80mm，L為8mm。CCD的像素1002×1024，對應空間長度8

8、nm。光斑單點化后，速度場測量分辨率可達80nm。(2) 工作距離工作距離為物鏡到標本的距離（已扣除蓋玻片的厚度約0.17mm）。這個參數對微流動實驗很重要，因為它限制了微流道觀測表面的厚度。對于100倍的物鏡，工作距離只有0.1mm。(3) 焦點深度和測量深度l 焦點深度顯微鏡光軸焦點上下可以看清物體的范圍叫做焦點深度或景深（Depth of field），由下式確定： (4)其中為介質折射率、NA為鏡頭數值孔徑、M為顯微鏡總放大率、e為圖像探測器的最小分辨率。當使用100倍物鏡和10倍目鏡時(M=100×10)，n=1.515，CCD在1×1工作模式下，e為8mm，則焦

9、點深度為0.522mm，可以清楚地觀察到焦點±0.261mm范圍內的物體。l 測量深度由于MicroPIV是體照明，Meinhart et al（2000）7按照測量區域內某一平面粒子灰度與焦平面粒子灰度的相關性確定沿光路的測量范圍，定義了測量深度。測量深度與焦點深度和粒子有效直徑有關。其計算公式為：（7）在60倍物鏡，NA=1.4下，測量深度約為±1.75mm。由于顯微鏡的景深和體照明特性，在目前MicroPIV系統中實現2D觀測比較困難，采用共聚焦顯微鏡可以改進平面觀測（見§3）。(4) 示蹤粒子l 熒光粒子宏觀PIV的示蹤粒子直徑>1mm，利用粒子散射

10、光采集速度信息。而MicroPIV利用的示蹤粒子直徑在50-500nm，其散射光不足以被觀測，因此采用熒光示蹤粒子。熒光是發射光，當入射光照到樣品上，樣品內分子運動狀態發生變化，樣品分子吸收外來光能從高能級回復到低能級釋放光能形成熒光。在理想情況下，一個分子大約能輻射出105106個熒光光子。高效單光子計數器可以檢測到5的熒光光子約5000個，足以探測到單個分子。l 布朗運動根據Einstein公式計算粒子擴散距離，Li et al (2003)4計算了定常流場中直徑200nm粒子可以忽略布朗運動的最小速度約為13mm/s。l 熒光粒子的濃度熒光粒子的濃度對背景噪音影響很大。Meinhart

11、et al（2000）7給出4種粒子濃度在4種測量距離下的信噪比。根據作者的實驗經驗，使用200nm粒子時，濃度范圍為0.020.1%為宜。(5) 光信號檢測器由于使用熒光粒子作為示蹤粒子，MicroPIV對CCD的光學靈敏度要求高。Lee (2005)8給出不同種類CCD適用的范圍(圖2)。微流動顯示至少需要選擇量子效率高和暗電流低增強CCD（ICCD）和冷卻CCD(Cooled CCD)。(6) 圖像處理技術圖2 不同種類CCD的量子效率示意圖王旻利和王元（2005）6詳細綜述了Micro-PIV圖像處理技術，可以參考。3. 激光共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal

12、 Microscope）圖3 共聚焦顯微鏡原理示意圖9圖4 共聚焦顯微鏡掃描系統示意圖103.1 原理共聚焦顯微鏡與傳統場式(wide field)顯微鏡相比具有控制焦深、降低背景雜光的優點。通過空間過濾技術去除非焦平面信息獲得光學切片。從一個點光源發射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦（圖3）。共聚焦光學系統是對樣品進行點照明，同時反射光也采用點感受器受光。只有與焦點重合的圖像會被輸出，因此無用的散亂光被屏蔽掉，有效地降低了背景干擾。共聚焦顯微系統可以用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像（圖4）。由于激光

13、束的波長較短，光束很細，所以激光共焦顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像。3.2 技術指標實用共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡（dichroic mirror），將已經通過透鏡的反射光折向一套微透鏡和光學針孔系統，將進入物鏡的光線再次聚焦，以克服普通顯微鏡焦點深度過大的影響。例如Olympus熒光顯微鏡IX70的景深為3mm，而共聚焦顯微鏡的景深只有0.5mm，可以更準確地顯示指定平面的圖像。Oshima et al (2005) 11使用CSU22(Yokogawa El

14、ectric Corp.) Confocal Micro-PIV系統具有1000幀/秒的采樣速度，在40×/NA=1.25物鏡采用500nm熒光粒子對血管流動進行了觀測。4. 全內反射熒光顯微鏡（Total Interior Reflect Fluency Microscope -TIRFM）4.1 原理光波從光密介質射向光疏介質，入射角大于臨界角時，會發生全反射現象。這時，盡管所有的光全部被反射回光密介質，但由于波動效應，部分光的能量會穿過光密介質透入光疏介質很薄的一層表面，平行于界面傳播。這種透入光疏介質表面的波，稱為隱失波（Evanescent wave）。在低折射率介質中隱失

15、波的典型滲透深度為100nm。如果樣品緊貼界面放置，則隱失波對樣品的垂直照射深度也為100nm。相比熒光顯微鏡的焦點深度23mm，共聚焦顯微鏡的焦點深度為500800nm，因此全內反射顯微鏡具有極高的信噪比。4.2 技術參數目前全內反射顯微鏡成像系統有兩種類型：棱鏡型和物鏡型12。l 棱鏡型系統，是讓激光通過棱鏡產生全內反射的同時，在界面處產生隱失波（圖5）。其特點是結構簡單，但放置樣品的空間受棱鏡的限制；l 物鏡型是顯微鏡的物鏡即作為接收樣品熒光信號的接收器，同時又作為發生全內反射的光學器件。要求物鏡的數值孔徑大于1.38。目前已用到NA=1.65的物鏡。其優點是樣品放置方便，容易與其他技術

16、結合。棱鏡法比較經濟，物鏡法的成本較高。圖5 全內反射顯微鏡原理示意圖12 圖6 實驗照片13蓋宏偉等（2005）13利用棱鏡型全反射顯微系統觀測了DNA分子的近壁流場的運動。使用儀器的主要參數，20×物鏡(NA=0.75)，微流道300mm×10mm，曝光時間111ms，22.1ms延遲，觀測范圍57.6 mm×86.4 mm。5. 分子示蹤技術（Molecular Tagging Method - MTV）5.1 原理MTV是在t時間間隔內，用兩束激光分別照射分子標記的區域（一般是分子標記的線），再用CCD記錄兩次照射的圖片，對圖片進行相關處理。圖7給出了裝置

17、示意圖，圖8為分子標記區域和速度場處理結果。MTV所采用的分子示蹤，不同于常用的熒光或激光誘導熒光(LIF)，它是利用磷光進行可視化。熒光是由于單基態分子向單激發態分子轉變過程中發射出的光，其過程是量子力學過程，持續時間往往只在10-910-7s范圍內；而磷光則是由單基態向多激發態轉變，其過程是非量子力學過程，所以持續時間比熒光時間長很多，可以達到10-3101s10。 圖7MTV裝置示意簡圖14 圖8.CCD拍攝的分子標記區域及處理得到的二維速度結果145.2 應用MTV技術最先是在宏觀尺度發展起來的，由Koochesfahani（1997）14（2001）15研究組提出，利用分子標記線的旋

18、轉來分析湍流運動。最近Hu et al.16又對該技術進行了發展，使其不僅適用于速度測量，還可以進行溫度測量。 但MTV測量設備和一般MicroPIV設備有一定的差別，例如MTV一般需要兩臺激光器來照射，如果需要觀察三維流動結果，則需要4臺激光器。另外由于磷光也有其衰減時間，那么CCD的拍攝速度也有一定的要求。根據文獻記載，為了避免磷光衰減過多，CCD的曝光時間多在幾個毫秒。6. 量子點技術（Quantum Dots - QD）6.1 原理量子點是化學合成的半導體納米粒子，其典型尺寸在110nm范圍。Murray et al.（1993）17最先報道了化學合成量子點的方法，Hines et a

19、l.（1996）18和Dabbousi et al.（1997）19進一步發展了量子點的制作方法。現在的量子點是以納米半導體晶體CdSe為核，鍍以ZnS為殼，最外層還鍍上高聚物以保持量子點的光學性質(圖9)。近年來，量子點已經被應用于生物標記20，并已逐漸被用于作為微流動實驗的示蹤粒子21。 量子點突出特點主要有以下4點：(1)QD粒徑介于傳統熒光粒子和示蹤分子之間，隨體性更好；(2)QD激發波長范圍很寬，有較高的激發強度(圖10), 而且激發持續時間比較長，穩定性好；(3)QD更適合于近壁區域的測量(配合TIF)，而這正是傳統熒光粒子缺點；(4)在光學顯微鏡下，QD的有效粒徑比傳統熒光粒子小

20、，這將有助于提高空間分辨率，減小判讀區，降低所需熒光液體濃度。 圖9QD結構示意圖22圖10各種顏色QD的激發譜226.2 應用QD在從生物化學方面的實驗觀測，到流動示蹤，都有很好的適用性。這主要是由其光穩定性好，光激發強度高，隨體性好的特點決定的。同時QD有多種被激發色，激發波長范圍寬，對激發光沒有特殊要求。同時量子點也存在著一些局限性，例如QD的制備合成過程比較麻煩，對環境的要求也比較高，配成的樣品也需要在比較潔凈溫度適宜的環境中保存。在測量時存在著量子點的閃現(blink)現象。這是由于粒徑太小，擴散系數大，強烈的布朗運動使量子點離開觀測的焦平面，以至于在一系列拍攝的圖片中無法找到對應的

21、粒子。7. 結論Micro-PIV是目前微流動顯示和速度測量的主要手段。為了改進焦點深度（23mm）影響，可以采用共聚焦顯微鏡Confocal（焦點深度為500800nm）和全內反射顯微鏡TIRFM（垂直照射深度為100nm）。為了提高對流場的觀測能力可考慮用分子點和量子點作為示蹤粒子。本文僅介紹了微尺度液體的流場顯示和速度測量，沒有綜述氣體微流動的測量，也沒有綜述其他流動參數（溫度、濃度和密度）的測量。感謝Olympus公司閻松純工程師和Cold Spring公司張博經理給予的技術咨詢。參 考 文 獻1 Santiago JG, Wereley ST, Meinhart CD, Beebe

22、DJ, Adrian RJ. A particle image velocimetry system for microfluidics, Experiment in Fluids. 1998, Vol.25, pp 316-319;2 Meinhart CD, Wereley ST, Santiago JG. PIV Measurement of a Microchannel flow Experiment in Fluids 1999, Vol.27, pp414-419;3 Stone SW, Meinhart CD and Wereley ST. A microfluidic-base

23、d nanoscope, Experiments in fluids. Vol.33, 613-619.4 Li ZH, Bstien O and Cui HH. Visualization of lower velocity flow field in microchannels, 7TH Asian Symposium on Visualization, 2003, Nov.3-7, Singapore.5 郝彭飛、何楓（2006），第六屆全國流動顯示會，2006.Oct13-16，福建；6 王旻利、王元. Micro-PIV技術粒子圖像測速技術的新進展.力學進展，2005,Vol.35,

24、 No.1, 77-90.7 Meinhart CD et al. Measurement Science Technology, 2000, Vol.11, pp809-814;8 Lee SJ. MicroPIV application, 8TH Asian Symposium on Visualization, 2005, May 23-26, Thailand.9 Yan SC. Laser Scanning Confocal Microscope. Technique paper, 2006.10 Ho CM. Visualization in the Micro/Nano doma

25、ins, 7TH Asian Symposium on Visualization, 2003, Nov.3-7, Singapore.11 Oshima M, Kinoshita H. and Bannodo Y. Visualization and measurement of blood flow in the macro and micro scales, 8TH Asian Symposium on Visualization, 2005, May 23-26, Thailand.12 王琛、王桂英、徐至展. 全內反射熒光顯微術.物理學進展,2006, Vol.12, No.4, 4

26、06-415.13 Gai HW, Li Y, Silber-Li ZH, Ma YF and Lin BC. Simultaneously measurements of the flow velocities in microchannel by wide/evanescent fields illuminations with particle/single molecules. Lab on a Chip, 2006, Vol.5 (4): 443- 449.14 Gendrich CP, Koochesfahani MM and Nocera DG. Molecular taggin

27、g velocimetry and other applications of a new phosphorescent supramolecule. Experiments in Fluids. 1997, Vol.23, 361-372.15 Bohl DG, Koochesfahani MM and Olson BJ. Development of stereoscopic molecular tagging velocimetry. Experiments in Fluids. 2001, Vol.30, 302-308.16 Hu H and Koochesfahani MM. Mo

28、lecular tagging velocimetry and thermometry and its application to the wake of a heated circular cylinder. Measurement Science and Technology. 2006, Vol.17, 1269-1281.17 Murray CB, Norris DJ and Bawendi MG. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE semiconductor Nanocrystallites. Jou

29、rnal of the American chemical society, 1993, 115(19):8706-8715.18 Hines MA, Guyot-Sionnest P. Synthesis and characterization of strongly luminescing ZnS capped CdSe nanocrystals. Journal of Physical Chemistry. 1996, 100(2):468-471.19 Dabbousi BO, Rodriguez-Viejo J, Mikulec FV, Heine JR, Mattoussi H, Ober R, Jensen KF and Bawendi MG. (CdSe)ZnS core-shell quantum dots: synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites. Journal of Physical Chemistry B. 1997, 101(46):9463-9475;20 Jaiswal J. Long-term multiple color imaging of