1、實驗一 分子生物學實驗室常用儀器設備簡介一、實驗目的 熟悉分子生物學實驗室常用儀器并熟練使用二、實驗原理 1、恒溫氣浴搖床：用于對溫度和振蕩頻率有較高要求的細菌培養，發酵，雜交，生化反應及酶和組織研究等。 2、超凈工作臺：用于分子生物學無菌操作。 3、低溫臺式高速離心機：用于分離純化DNA和蛋白質等，如基因片段的分離，蛋白酶的沉淀和回收等。 4、微量移液管：是連續可調的，計量和轉移液體的專用儀器，其裝有直接讀數容量計。有多種規格：L10-100L20-200L100-1000L。 5、電泳儀：用于確定大分子物質的分子量以及鑒定物種親緣關系的儀器。 6、PCR儀：用于目的基因的擴增，是一對寡糖核

2、苷酸引物結合到正負DNA鏈上的靶序列兩側，從而酶促合成拷貝數為百萬倍的靶序列DNA片段。主要用于基礎研究和應用研究等領域。 7、滅菌鍋：用于細菌和細胞培養及核酸等有關實驗使用的試劑，器皿及實驗用具的嚴格滅菌。三、實驗儀器恒溫氣浴搖床、超凈工作臺、低溫臺式高速離心機、微量移液管、滅菌鍋、PCR儀、電泳儀。四、實驗步驟（一）、恒溫氣浴要穿的使用：1、樣品瓶牢固放入彈簧夾中2、接通電源開關，儀器進入準備狀態 3、參數設定，（設定溫度、時間、轉速等參數 ）4、按啟動鍵儀器開始工作，按暫停鍵可暫停托盤的旋轉； 5、按電源鍵，顯示屏顯示消失，關閉電源總開關（二）、超凈工作臺的使用1、使用工作臺時，先經過清

3、潔液浸泡的紗布擦拭臺面，然后用消毒劑擦拭消毒。 2、接通電源，提前30分鐘打開紫外燈照射消毒，處理凈化工作區內工作臺表面積累的微生物，15分鐘后，關閉紫外燈，開啟送風機。 3、工作臺面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區內的潔凈氣流不受干擾。 4、操作結束后，清理工作臺面，收集各廢棄物，關閉風機及照明開關，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。 5、最后開啟工作臺紫外燈，照射消毒30分鐘后，關閉紫外燈，切斷電源。 （三）、低溫臺式高速離心機的使用1、把離心機放置于平面桌或平面臺上，目測使之平衡，用手輕搖一下離心機，檢查離心機是否放置平衡。2、打開門蓋，將離心管放入轉子內，離心管必須成偶數對稱放入，且要事

4、先平衡，完畢用手輕輕旋轉一下轉子體，使離心管架運轉靈活。3、關上門蓋，注意一定要使門蓋鎖緊，完畢用手檢查門蓋是否關緊。4、插上電源插座，按下電源開關（電源開關在離心機背面，電源座上方）。5、設置轉子號、轉速、時間：在停止狀態下時，用戶可以設置轉子號、轉速、時間，此時離心機處于設置狀態，停止燈亮、運行燈閃爍；按下啟動離心開始 （常用，最高轉速為13000r/min，時間最長為20分鐘）；注意：對應的轉子一定要設置在相應的轉速范圍內，不可超速使用，否則對試管或轉子有損壞。6、離心機時間倒計時到“0”時，離心機將自動停止，當轉子停轉后，打開門蓋取出離心管，關斷電源開關。（四）、微量移液管的使用1 將

5、微量移液器裝上吸頭（不同規格的移液器用不同的吸頭）2 將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點；3 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部；4 緩慢、平穩地松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進入吸嘴太快，導致液體倒吸入移液器內部，或吸入體積減少；5 等一秒鐘后將吸嘴提離液面6 平穩地把按鈕壓到第一停點，再把按鈕壓至第二停點以排出剩余液體；7 提起微量移液器，然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。 （五）、PCR的使用 1、開機：打開開關，視窗上顯示“SELF TEST”。2、放入樣品管，關緊蓋子。 3、如果要運行已經編好的程序，則直接按Proceed， 用箭頭鍵選擇已

6、儲存的程序，按Proceed，則開始執行程序。 4、如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTER PROGRAM,按Proceed， 1）命名新的程序，最多8個字母，輸入后按Proceed確認(如何輸入字母、數字)。 2）輸入程序步驟：名字輸入后，確認，然后輸入相關程序5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運行。 6、其它：用pause可以暫停一個運行的程序，再按一次繼續程序。用stop或Cancel可停止運行的程序。 （六）、 電泳儀的使用1 首先用導線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯接，注意極性不要接反。2按電源開關，顯

7、示屏出現“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀”等字樣后，同時系統初始化，蜂鳴4聲，設置常設置。屏幕轉成參數設置狀態，根據工作需要選擇穩壓穩流方式及電壓電流范圍。3確認各參數無誤后，按“啟動”鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態欄中顯示Start! 并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設置值。同時在狀態欄中顯示“Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態欄最下方，顯示實際的工作時間（精確到秒） 4電泳結束，儀器顯示：“END”，并連續蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴（七）、高壓滅菌鍋1、開蓋：轉動手輪，使鍋蓋離開密封圈，添加蒸餾水剛

8、沒至板上2、通電：將控制面板上電源開關按至ON處，若水位低（LOW）紅燈亮 3、堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內，這樣有利 于蒸汽的穿透，提高滅菌效果 ，滅菌時間： 121， 20min，；如為液體，液體必須裝在可耐高溫的玻璃器皿中，且不可裝滿，2/3即可， 121， 18-20min4、密封高壓鍋：推橫梁入立柱內，旋轉手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊 5、設定時間和溫度，開始滅菌6、滅菌結束，所有東西放入干燥箱干燥，排盡水氣五、思考題1、列出分子生物學常用儀器的名稱，用途及操作時的注意事項。 答：恒

9、溫氣浴搖床：常用于液體搖勻以培養微生物、細菌和細胞等。注意要依據不同的用途設置不同的參數。超凈工作臺：常用于為微生物學實驗提供無菌操作環境。注意操作時關掉紫外燈，避免給人類帶來傷害。低溫臺式高速離心機：常用于分離純化蛋白、病毒、細胞等。使用時不能隨便移動離心機或打開蓋子；離心機運行時要處于鎖定狀態；離心管的放置要處于平衡狀態。微量移液管：用于計量和轉移微量液體的專用儀器。操作時注意避免槍頭的污染；調節刻度時不宜超過最大量程；使用完后將刻度調到最大收藏。電泳儀：可對不同物質進行定性或定量分析，或將一定混合物進行組分分析或單個組分的提取制備。操作時不可把導線極性接反；當電泳儀進入工作狀態后，避免人

10、體與其各部分的接觸，不同介質支持物的電泳不要同時在同一電泳儀上進行；若使用時出現異常，要立刻切斷電源。PCR儀：用于擴增DNA片斷。操作時應注意蓋子要蓋緊，按正確步驟進行。高壓高溫滅菌鍋：用于殺菌消毒。使用時應嚴格按照規程操作，避免發生安全事故。實驗二 瓊脂糖凝膠電泳的制備及核酸檢測一. 實驗目的1、掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理;2、學習瓊脂糖凝膠電泳的操作。二. 實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同D

11、NA，其分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關系。溴化乙錠（EB）未扁平狀分子，在紫外照射下發射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其發射的熒光強度較游離狀態EB發射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA含量成正比。三、儀器和試劑儀器： 微量移液器，電泳儀，電泳槽，微波爐 試劑： 瓊脂糖：1.0%；電泳緩沖液（50 × TAE 電泳緩沖液取Tris ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸餾水至100ml ） EB：5

12、 µl / 100 ml TBE 電泳材料：標準分子量核酸（DL2000）四. 操作步驟（1）制膠（以20 mL為例） a. 稱取0.2 g 瓊脂糖，加入20 ml 的1XTAE緩沖液（pH 8.0），搖勻； b. 微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）； c.將制膠板放入制膠槽中，插入適當的梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）加入2ul EB后，混均勻，倒入其中，直至厚度為46 mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30 45 min)； d.小心垂直向上拔出梳子,以保證點樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。（2）點樣 用微量移液器將5 µl含藍色染液的 DL2000 加入點樣孔下部。（3）電泳 打開電源開關，調節電壓至35 V/cm(約100 V)，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約30-40分鐘后即可觀察結果。（4）觀察將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。如同時有已知分子量的標準DNA進行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。五、實驗結果點樣時效果較好的照片點出的白色熒光線比較亮