1、生物技術(shù)通報BIOTECHNOLOGY BULLETIN技術(shù)與方法2007年第3期收稿日期:2006-12-26基金項目:國家轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項項目(J2002-B-006;教育部“新世紀優(yōu)秀人才”支持計劃作者簡介:王瑩(1982-,女,在讀碩士研究生,研究方向:草坪草生物技術(shù),E-mail:wangyinghouzi 通訊作者:韓烈保(1965-,男,博士生導(dǎo)師,研究方向:草坪草育種,Email:hanlb,電話:010-*啟動子(promoter 是一段提供RNA 聚合酶識別和結(jié)合的DNA 序列,它位于基因的上游,其長度因生物種類而異,一般不超過200bp 。一旦RNA 聚合酶定位

2、并結(jié)合到啟動子序列上,即可啟動轉(zhuǎn)錄1。根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA 聚合酶的種類可把真核生物的啟動子分為三類:rRNA 基因啟動子(I 型、mRNA 基因啟動子(II 型和tRNA 基因啟動子(III 型。I 型啟動子和III 型啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游,結(jié)構(gòu)相對簡單。高等植物啟動子屬于型啟動子,該型啟動子相對復(fù)雜,大多數(shù)位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游。植物基因工程中常用的啟動子按其功能及作用方式可將它們分為三類:組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織特異型啟動子。1啟動子結(jié)構(gòu)和功能的研究現(xiàn)狀1.1啟動子功能和結(jié)構(gòu)研究的策略目前,研究啟動子功能的方法主要有瞬間轉(zhuǎn)化分析、突變分析,以及近年來發(fā)展起來的R

3、NA 干涉技術(shù)等。報告基因(Report gene ,通過載體主要是質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細胞,分析檢測轉(zhuǎn)基因植物中報告基因的表達,結(jié)合構(gòu)建不同的缺失(deletion 序列,從而確定負責(zé)組織特異性表達的作用序列和調(diào)控元件。研究較多的有CaMV35S 啟動子2和農(nóng)桿菌(Agrobacterium 中高等植物啟動子克隆方法的研究進展王瑩韓烈保曾會明(北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所,北京100083摘要:啟動子是植物基因工程中一個重要的研究對象,文章簡述了啟動子的定義、分類和啟動子的研究策略,從組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子3個方面介紹了它們的功能和結(jié)構(gòu)的研究現(xiàn)狀。啟動子的克隆對于構(gòu)建基因工程載體

4、,表達目的蛋白有著重要的意義。著重介紹了啟動子克隆的方法,從常用的利用啟動子探針型載體篩選啟動子到PCR 方法的應(yīng)用,及此后相繼出現(xiàn)的一些基于PCR 法的克隆啟動子技術(shù),像I -PCR ,P -PCR ,SSP -PCR ,YADE ,TAIL -PCR等,為克隆啟動子提供了更可靠,更合理的方法。關(guān)鍵詞:啟動子基因工程克隆PCRAdvances on Studies of Plant PromotersWang Ying Han LiebaoZeng Huiming(Turfgrass Institute of Beijing Forestry University ,Beijing 1000

5、83Abstract :As the promoter is an important research object in the plant genetic engineering ,the article sketches itsdefinition ,classification and research tactics.Meanwhile ,the function and structure of the promoter are emphasized in respect of constitutive type ,organ -specific type and inducib

6、le type.Promoter is an important cis -acting element ,it is also an important element of gene engineering expression vectors.The way of promoter cloning is important for constricting gene engineering vectors and expressing the aim proteins.From the frequently used way that applying probe vectors for

7、 choosing promoter to the using of PCR ,there were lots of ways for promoter cloning.Afterwards ,a series of techniques based on PCR for promoter cloning such as I -PCR ,P -PCR ,SSP -PCR ,YADE ,TAIL -PCR were developed in succession.They offered more reliable and reasonable ways of cloning the promo

8、ter.Key words :PromoterGenetic engineering Cloning PCR生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2007年第3期質(zhì)粒有關(guān)基因啟動子。1.2組成型啟動子的功能和結(jié)構(gòu)特征該類型啟動子稱之為非特異性表達組成型啟動子(constitutive promoter由這類啟動子控制的結(jié)構(gòu)基因的表達大體恒定在一定水平上,在不同組織部位表達水平也沒有明顯差異。其特點是:表達具持續(xù)性,RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對穩(wěn)定;不表現(xiàn)出時空特異性,也不受外界因素的誘導(dǎo)影響。從結(jié)構(gòu)上看,大多數(shù)組成型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾百個核苷酸處,存在有六聚體花紋(he

9、xamer motifs序列TGACTG。目前使用最廣泛的兩個組成型啟動子是煙草花葉病毒(CaMV35S啟動子和來自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂堿合成酶基因啟動子(Nos和章魚堿合成酶基因啟動子(Ocs。另外,水稻Actl啟動子序列結(jié)構(gòu)也研究得比較清楚5。1.3組織特異型啟動子的功能和結(jié)構(gòu)組織特異性啟動子也稱之為器官特異性啟動子(organ-specific promoter。在這些啟動子調(diào)控下,基因的表達往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位,并表現(xiàn)出發(fā)育上的時空特異性。這種類型的啟動子最大優(yōu)點是:它所啟動的外源基因在受體植物中特異表達,從而克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物

10、中非特異性的持續(xù)、高效表達所造成浪費,而在需要該基因大量表達的特定組織部位則因表達量過低又達不到預(yù)期效果6。例如:種子特異性啟動子(nap inB promoter,甘藍型油菜BcNA1基因啟動子和玉米醇溶貯藏蛋白基因啟動子被分別轉(zhuǎn)入煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株79。雖然組織特異性啟動子一直以來都是植物基因工程中研究的重點和難點,但在根、維管束和韌皮部特異表達啟動子研究中還是取得了很大進步。1.4誘導(dǎo)型啟動子的功能和結(jié)構(gòu)所謂誘導(dǎo)型啟動子就是在某些特定的物理或化學(xué)刺激下,此種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平,因此,亦稱為誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)序列或誘導(dǎo)型增強子(inducible enhancer。該類啟動

11、子的共同特點如下:啟動子的水利化受到物理或化學(xué)信號的誘導(dǎo);啟動子的分子結(jié)構(gòu)都具有增強子,沉默子或類似功能的序列結(jié)構(gòu);感受牧民性誘導(dǎo)的序列都必須有明顯的專一性;一部分該類型的啟動子同時具組織特異性表達特點。該類啟動子通常以誘導(dǎo)信號命名,可分為光誘導(dǎo)表達基因啟動子、熱誘導(dǎo)表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達基因啟動子、激素誘導(dǎo)表達基因啟動子等。Tada等10把LHCP基因與GUS連接形成嵌合體轉(zhuǎn)化水稻,黑暗中生長的植株檢測不到表達活性,但在光照后誘導(dǎo)表達。此外,泛素核糖體蛋白融合基因ubi3、馬鈴薯pin2基因啟動子都屬于受到創(chuàng)傷誘導(dǎo)時才能啟動下游基因表達的啟動子11。2啟動子的克隆方法隨著基因工程的發(fā)展

12、,常常需要構(gòu)建一種能高水平表達異源蛋白質(zhì)的表達載體。啟動子對外源基因的表達水平影響很大,是基因工程表達載體的重要元件。因此,研究啟動子的克隆方法,對研究基因表達調(diào)控和構(gòu)建表達載體至關(guān)重要12。近年來有許多改進的克隆啟動子的方法獲得了多方面的成功,本文就近年來改進的啟動子克隆方法作一綜述,以期促進對啟動子分離技術(shù)的應(yīng)用。2.1利用啟動子探針載體篩選啟動子利用啟動子探針載體篩選啟動子是一種常用的方法。它是利用缺失啟動子的產(chǎn)物易檢測的報告982007年第3期基因,構(gòu)建啟動子探針質(zhì)粒載體來克隆有啟動功能的DNA片段。其一般程序是:先選用一種適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶,消化切割染色體DNA;接著將切割產(chǎn)生的D

13、NA限制片段群體與一種無啟動子的質(zhì)粒載體重組,并按照設(shè)計的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報告基因的上游位置;隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細胞,構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫,并檢測報告基因的表達活性。最早由Rachael等13在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報告基因構(gòu)建了啟動子探針質(zhì)粒pBRH3B,并克隆了一些原核和真核啟動子片段。其后Donna等14以氯霉素抗性基因作為報告基因,Fodor 等15以大腸桿菌LacZ為報告基因,構(gòu)建了酵母啟動子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動子片段。李維等16曾構(gòu)建了含有hph抗性基因的啟動子探針型載體pSUPV8,直接在大腸桿菌中分離黃抱原毛平革菌基因的啟動子。該方法不需要知道

14、具體基因的序列,可隨機篩選啟動子,避免了引物設(shè)計,能獲得大量的啟動子片段。2.2利用PCR技術(shù)克隆啟動子根據(jù)發(fā)表的基因序列,設(shè)計引物,克隆基因的啟動子,由于PCR法簡便快捷,近年來人們較多采用此方法克隆基因啟動子。蘇寧等17根據(jù)已報道的水稻葉綠體16S rRNA 啟動子基因序列設(shè)計5啟動子序列的引物,以水稻葉綠體DNA為模板,PCR擴增出16S rRNA基因5啟動子區(qū)的片段。彭仁旺等18根據(jù)已報道的序列設(shè)計引物,通過PCR擴增,從煙草中克隆了花藥特異表達基因TA29的啟動子。蔣浩等19用PCR方法從美洲黑楊基因組DNA中擴增到了BSA基因啟動子片段。上述的PCR方法簡便、快捷、操作簡單,是人們

15、轉(zhuǎn)為廣泛使用的技術(shù)。2.3環(huán)狀PCR環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR和P-PCR (Panhandle-PCR。這2種PCR都是根據(jù)一端已知序列設(shè)計的嵌套式引物進行PCR。韓志勇等21以I-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列。李竹紅等22利用改進的反向PCR方法克隆了Tc1轉(zhuǎn)座子左側(cè)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列的旁側(cè)序列。王新國等23采用銜接頭PCR方法,從胡蘿卜基因組DNA中成功地克隆到一個新的s基因啟動子片段。Jones等25利用改進的P-PCR,在形成panhandle 結(jié)構(gòu)之前3末端連上ddCTP,使引物錯配的機率減少,特異性增加。P-PCR是目前能夠擴增距已知序列最遠

16、的未知DNA序列的方法,有很高的特異性。2.4YADE法Prashar等26在擴增cDNA3端時采用“Y”形接頭,以減少接頭引物的單引物擴增。其原理是接頭引物處于“Y”接頭的2個分叉單鏈上,序列與接頭一樣,只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補序列后,接頭引物才能退火參與擴增。YADE法延伸的起始片段可以是基因組DNA 片段,也可以是cDNA片段,在延伸cDNA片段時,設(shè)計的引物需要避開內(nèi)含子和外顯子的邊界,在內(nèi)含子的位置未知的情況下,可考慮多合成12條特異引物,以提高擴增未知片段的機率。該方法假陽性低、效率高,理論上能擴出所有目的片段。2.5TAIL-PCR很早就有用隨機引物的PCR,但由于無法

17、有效地控制由隨機引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生,所以一直未能廣泛應(yīng)用。近年來由Liu等27設(shè)計的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR又叫熱不對稱交錯PCR,則解決了這個問題。后來有研究表明,經(jīng)改良過的TAIL-PCR28成功地從突變體中克隆到外源插人基因的旁側(cè)序列,從而為啟動子的克王瑩等:高等植物啟動子克隆方法的研究進展99生物技術(shù)通報Biotechnology Bulletin2007年第3期隆提供了有效的新方法。Gento等29曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因(hph的雙元表達載體pBIG2RHPH2轉(zhuǎn)化真菌,然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)

18、化子基因組DNA的T-DNA插人區(qū)的旁側(cè)序列并取得了成功。TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作,避免了環(huán)化和連接,速度快,特異性強,效率高,靈敏,在分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。3問題與展望近20年人們在啟動子研究方面進行了大量的工作,不僅克隆到數(shù)量豐富的啟動子,而且對其結(jié)構(gòu)和功能有了一定的認識。但從遺傳信息到基因的表達是一個十分復(fù)雜的過程,還有許多問題有待解決。基因表達與否以及表達時間、表達部位需要啟動子上的順式作用元件與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。從植物中已知的啟動子分析,組織特異性及誘導(dǎo)型啟動子的順式作用元件有一定的保守性,如B-box是種子特異啟動子的高度保守區(qū)30,

19、G-box 通常受光敏色素A誘導(dǎo),參與多種信號調(diào)節(jié)3032。而且,啟動子驅(qū)動基因表達通常需要兩種或兩種以上的順式元件,這些元件的種類、數(shù)量以及彼此之間的順序與距離都可能影響基因的轉(zhuǎn)錄與否或轉(zhuǎn)錄程度。如果能發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律,將會對基因表達的調(diào)控取得突破性進展。另外,基因的特異性表達不僅包括在特定時期激活某些基因的表達,還涉及到在其他組織器官或發(fā)育時期抑制某些基因的表達,對抑制子的研究將使人們更好地理解基因表達的調(diào)控過程。目前,啟動子克隆的方法種類繁多,進展迅速。啟動子克隆方法絕大多數(shù)是建立在PCR的基礎(chǔ)上的染色體步行技術(shù),因而利用啟動子克隆的方法不僅可以克隆到基因的啟動子,同時還可以用于克隆cDN

20、A的全長33。分子生物學(xué)的一個重要問題是如何利用大量積累的基因部分序列(如EST進一步克隆全長基因及其調(diào)控序列,而啟動子克隆方法為這一問題提供了簡便有效的手段。另外,隨著基因工程的發(fā)展,出現(xiàn)了越來越多的轉(zhuǎn)基因植物,啟動子克隆的方法也可以應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因生物的研究中,如轉(zhuǎn)基因水稻的T-DNA區(qū),通過啟動子克隆方法的PCR步行技術(shù),能成功地克隆到T-DNA區(qū)的旁側(cè)序列,有助于分析突變體中突變區(qū)序列。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展,將有更多的啟動子序列得到分析,各順式作用元件的功能也會逐漸明確。組織特異型、誘導(dǎo)型、雙向和串聯(lián)等啟動子應(yīng)用技術(shù)的成熟將有力推動植物基因工程的進步?？梢灶A(yù)言,對植

21、物啟動子的深入研究和正確應(yīng)用一定會給人類生活帶來不可估量的作用。參考文獻1夏江東,夏平.楚雄師范學(xué)院學(xué)報,2005,20(3:4148.2焦改麗,等.作物學(xué)報,2004,30(11:11351139.3鐘蓉,李勝國,潘照明.四川大學(xué)學(xué)報,1997,34(6:847851.4齊春輝,等.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,28(3:7175.5劉發(fā)央,侯路珍,謝小冬.草原與草坪,2005,3:6671.6皮燦輝,易自力,王志成.中國生物工程雜志,2003,23(1:14. 7李麗,張景昱,杜林森.植物學(xué)通報,2001,18(2:216220.8石東喬,周奕華,萬里紅.植物生理學(xué)報,2001,27(4:3

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