1、華中科技大學同濟醫學院生物化學系華中科技大學同濟醫學院生物化學系 2011.102011.10 Kerr教授教授19721972年我和年我和WyllieWyllie在在研究中觀察到一種不研究中觀察到一種不同于壞死的細胞死亡同于壞死的細胞死亡方式，聯想到秋日落方式，聯想到秋日落葉，我們葉，我們 就把它稱作就把它稱作ApoptosisApoptosisApoptosis是是 apo apo （off off 離去之意）和離去之意）和ptosis ptosis （falling falling 凋落之意）的合成詞，描述樹葉及凋落之意）的合成詞，描述樹葉及花瓣散落之意花瓣散落之意一、細胞凋亡的概念細胞

2、凋亡的概念二、細胞凋亡的生理意義細胞凋亡的生理意義三、細胞凋亡的特征細胞凋亡的特征四、細胞凋亡的激發因素細胞凋亡的激發因素High magnification micrograph showing contraction band necrosis, a special subtype of coagulative necrosis seen in cardiac myocytes. H&E stain. Necrotic leg wound caused by a brown spider bite H1核心顆粒核心顆粒連接區連接區180-200 bp內源性核酸內切酶2+2+ 2+（

3、三）細胞凋亡與細胞壞死（三）細胞凋亡與細胞壞死細胞凋亡的誘發因素細胞凋亡的誘發因素細胞凋亡的抑制因素細胞凋亡的抑制因素Bcl-2蛋白家族成員概況蛋白家族成員概況Bcl-2 Bcl-2 蛋白家族成員的相互作用與細胞凋亡的關系蛋白家族成員的相互作用與細胞凋亡的關系Caspase分組分組按前區域含有的按前區域含有的嗜同性區段嗜同性區段分：分：1.CARD-Caspases：含有含有90-100aa組成的組成的caspase recuitment domain，如：，如：caspase-1, 2,4,5,9,11,12,13。2.DED-Caspases：含有含有75-80aa組成的組成的death

4、effector domain，如：，如：caspase-8,103. 下游下游caspases：前區域小，不含前區域小，不含嗜嗜同性區段，同性區段，如如caspase-3,6,7 最近研究證實，在線粒體的內外膜間腔中含有最近研究證實，在線粒體的內外膜間腔中含有許多涉及細胞凋亡的因子，包括其中特含有的許多涉及細胞凋亡的因子，包括其中特含有的細胞色細胞色素素C C（cytochrome ccytochrome c，CytcCytc），凋亡誘導因子（），凋亡誘導因子（AIFAIF）和第二個線粒體的和第二個線粒體的CaspaseCaspase激活因子激活因子SMACSMAC（second secon

5、d mitochondria-activator of caspasemitochondria-activator of caspase），），以及與胞以及與胞漿內共含有的漿內共含有的Pro-Caspase-2Pro-Caspase-2，3 3，7 7，9 9等。很多內外等。很多內外因素損傷了線粒體膜的完整性，促使線粒體釋放出這因素損傷了線粒體膜的完整性，促使線粒體釋放出這些凋亡因子，即可誘導細胞凋亡。現已公認細胞內存些凋亡因子，即可誘導細胞凋亡。現已公認細胞內存在有在有死亡受體介導死亡受體介導、內質網內質網和和線粒體線粒體介導介導的三條細胞的三條細胞凋亡途徑。凋亡途徑。 Fas介導的信號轉導

6、途徑介導的信號轉導途徑FasLFasL同靶細胞膜表面同靶細胞膜表面FasFas結合結合FasFas胞漿段內的胞漿段內的死亡結構域死亡結構域（DDDD）結合）結合FasFas結合蛋白結合蛋白FADDFADD（fas associated Protein with DDfas associated Protein with DD）FADDFADD再以其再以其N N端的端的死亡效應子結構域死亡效應子結構域（death effector death effector domaindomain，DEDDED）結合）結合Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8（或（或-10-10），形成誘導死

7、），形成誘導死亡的信號復合體（亡的信號復合體（death inducing signaling complexdeath inducing signaling complex，DISCDISC）（）（Fas-FADD-Pro-Caspase-8Fas-FADD-Pro-Caspase-8（或（或-10-10）Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8（或（或-10-10）自身活化成）自身活化成Caspase-8Caspase-8（或（或10)10)，激活下游的靶激活下游的靶Pro-CaspasesPro-Caspases（包括（包括Pro-Caspase-3Pro-Caspase-3

8、，-6-6，-7-7）Fas Fas 介導的介導的DaxxDaxxJNKJNK途徑途徑 19971997年年YangYang等發現另一種蛋白質分子，含有等發現另一種蛋白質分子，含有739739個氨基酸殘基，其個氨基酸殘基，其C C端端115115個氨基酸區段雖不與個氨基酸區段雖不與DDDD同源，但能結合同源，但能結合FasFas的的DD,DD,該分子稱為該分子稱為DaxxDaxx（Fas Fas death domain associated Proteindeath domain associated Protein），結合），結合FasFas后可后可激活激活JNK/SAPKJNK/SAPK

9、導致細胞凋亡導致細胞凋亡，此途徑不受，此途徑不受FLIPFLIPL L (Fas(Fas抑制蛋白抑制蛋白) )抑制。抑制。 因此，因此，FasFas介導凋亡有二條分叉途徑：一條是介導凋亡有二條分叉途徑：一條是可被可被FLIPFLIPL L抑制的途徑，另一條是不被抑制的途徑，另一條是不被FLIPFLIPL L抑制的抑制的Daxx-JNKDaxx-JNK途徑途徑 4. Fas4. Fas介導的凋亡信號轉導的介導的凋亡信號轉導的負性負性調控調控（1 1）FasFas磷酸酶磷酸酶-1-1（Fas-associated phosphatase-1Fas-associated phosphatase-1，

10、FAP-1FAP-1）：結合：結合FasFas的抑制區域（的抑制區域（SDSD），抑制），抑制FasFas誘導的誘導的凋亡。凋亡。（2 2）FasFas抑制蛋白（抑制蛋白（FLIPFLIPL L）：N N端含有端含有2 2個死亡效應子結個死亡效應子結構域（構域（Death effector domain, DEDDeath effector domain, DED），），C C端含有端含有Caspase-8/-10Caspase-8/-10樣蛋白酶區，但其活性中心樣蛋白酶區，但其活性中心QACRGQACRG中的中的C C換以換以Y Y，無，無CaspasesCaspases樣的酶活性。因此樣的

11、酶活性。因此FLIPFLIPL L可借其可借其DEDDED競爭結合競爭結合Pro-Caspase-8Pro-Caspase-8的前區域而阻止其與的前區域而阻止其與FADDFADD結合結合，抑制抑制FasFas介導的凋亡反應。介導的凋亡反應。 其受體當其受體當TNFTNF結合后，誘導結合后，誘導TNF-R1TNF-R1胞漿段的胞漿段的死亡結構域（死亡結構域（DDDD）結合亦含有）結合亦含有DDDD的接頭分子腫瘤的接頭分子腫瘤壞死因子受體壞死因子受體-1-1結合蛋白（含結合蛋白（含DDDD）（）（TNFR1-TNFR1-associated Protein with DDassociated Pr

12、otein with DD，TRADDTRADD），后者），后者再借其死亡結構域（再借其死亡結構域（DDDD）同步串聯結合多種亦含）同步串聯結合多種亦含DDDD的下續接頭分子，進入多條凋亡途徑：的下續接頭分子，進入多條凋亡途徑： TNF-R1TNF-R1介導的凋亡途徑介導的凋亡途徑順序串聯結合順序串聯結合RIP RIP 、RAIDDRAIDD、 Procaspase-2 Procaspase-2 ：RIP RIP （Receptor interacting Protein with DDReceptor interacting Protein with DD）：）：其其C C端含有端含有DDD

13、DRAIDD RAIDD （RIP-associated ICH1 Homologous RIP-associated ICH1 Homologous Protein with DD and CARDProtein with DD and CARD）：其）：其N N端含端含CARDCARD，C C端端含含DDDD，其，其CARDCARD結合結合Pro-caspase 2Pro-caspase 2形成誘導死亡的形成誘導死亡的信號復合體（信號復合體（DISCDISC）。）。結合結合FADDFADD（其（其C C端含有端含有DDDD）進入）進入FasFas介導的凋亡介導的凋亡途徑。途徑。TRADD-

14、RIPTRADD-RIP還可結合還可結合TRAF2:TRAF2: TRAF2 (TRAF2 (TNFR-associated factor 2TNFR-associated factor 2）: :激活激活NIKNIK（NF-B-inducing KinaseNF-B-inducing Kinase）和）和IKK1/2IKK1/2（IKB-Kinase1/2IKB-Kinase1/2），后者再磷酸化并促使），后者再磷酸化并促使IKB/IKB/被泛素化蛋白分解，釋放出活性的被泛素化蛋白分解，釋放出活性的NF-BNF-B，促進二種凋亡因子促進二種凋亡因子IAPIAP（Inhibitor of ap

15、optosis Inhibitor of apoptosis proteinprotein）和）和IEX-1IEX-1（Immediate-early response Immediate-early response genegene）表達而促進）表達而促進TNF-R1TNF-R1介導的細胞凋亡。介導的細胞凋亡。TRADDTRADD直接順序串聯結合直接順序串聯結合TRAF 2TRAF 2和和CARDIAKCARDIAKCARDIAKCARDIAK： （CARD inducible apoptotic kinase/RIP 2CARD inducible apoptotic kinase/RI

16、P 2），），以其以其C C端的端的CARDCARD結合結合Pro-Caspase1Pro-Caspase1形成形成DISCDISC。FLIPL（large form of FLICE inhibitory protein, caspase-8抑制蛋白）抑制蛋白） FLIP將將Fas介導介導的信號由凋亡的信號由凋亡轉變為增殖的轉變為增殖的開關作用開關作用性）性）Receptor & Mitochondria Mediated Apoptosis Signaling在線粒體外膜和內膜之間的膜間腔內存在有許在線粒體外膜和內膜之間的膜間腔內存在有許多凋亡因子。在正常時線粒體外膜的通透性一般只

17、允多凋亡因子。在正常時線粒體外膜的通透性一般只允許許5KD5KD的小分子和離子進出，當受某些因素作用破壞的小分子和離子進出，當受某些因素作用破壞了線粒體外膜的這種屏障性通透，引起膜間腔內儲存了線粒體外膜的這種屏障性通透，引起膜間腔內儲存的凋亡因子釋放入胞漿內，立即啟動凋亡反應。膜間的凋亡因子釋放入胞漿內，立即啟動凋亡反應。膜間腔內的凋亡因子有：腔內的凋亡因子有：Cyt.cCyt.c, , 凋亡誘導因子（凋亡誘導因子（AIFAIF）, , 第二個第二個CaspaseCaspase的線粒體的線粒體激活因子（激活因子（SmacSmac）, , Pro-Pro-caspase-2,-3,-7,-9ca

18、spase-2,-3,-7,-9和和Hsp-10, Hsp-60Hsp-10, Hsp-60等。等。一、線粒體內的凋亡因子一、線粒體內的凋亡因子1 1Cyt.cCyt.c： 由線粒體膜間腔釋放入胞漿后，可結合凋亡激由線粒體膜間腔釋放入胞漿后，可結合凋亡激活因子活因子-1-1（Apaf-1Apaf-1） 誘導其寡聚化，再募集誘導其寡聚化，再募集Pro-Pro-Caspase-9Caspase-9形成凋亡體（形成凋亡體（ApoptosomeApoptosome），在），在dATP/ATPdATP/ATP參與下參與下Pro-Caspase-9Pro-Caspase-9自身激活形成活性自身激活形成活性

19、的的Caspase-9,Caspase-9,再級聯反應激活下游再級聯反應激活下游CaspasesCaspases導致細導致細胞凋亡胞凋亡 其進入胞漿內后還可進一步影響線粒體外膜通透其進入胞漿內后還可進一步影響線粒體外膜通透性，故有促進細胞凋亡放大作用。性，故有促進細胞凋亡放大作用。AIFAIF是一種是一種DNADNA內切內切酶，可直接轉位入核內催化酶，可直接轉位入核內催化DNADNA約約50Kb50Kb的大片段化，的大片段化，與與DNADNA片段化因子片段化因子DFF40DFF40（DNA fragmentation factorDNA fragmentation factor）協同加速）協同

20、加速DNADNA的有序片段化。的有序片段化。2 2凋亡誘導因子（凋亡誘導因子（AIFAIF） 是分子量為是分子量為10KD10KD和和60KD60KD的二種熱休克蛋白分子的二種熱休克蛋白分子，它們具有易化激活，它們具有易化激活Pro-CaspasesPro-Caspases的作用，故亦是的作用，故亦是誘導細胞凋亡的因子。誘導細胞凋亡的因子。3 3HSP10/60HSP10/60（Heat shock protein 10/60Heat shock protein 10/60） 第二個第二個CaspaseCaspase的線粒體激活因子的線粒體激活因子 （Second Second Mitocho

21、ndria-derived activator of Caspase, Mitochondria-derived activator of Caspase, SmacSmac） 。以純二聚體形式自然存在于線粒體膜間。以純二聚體形式自然存在于線粒體膜間腔內腔內, , 釋放入胞漿內可結合凋亡蛋白抑制因子（釋放入胞漿內可結合凋亡蛋白抑制因子（Inhibitor of apoptotic proteinInhibitor of apoptotic protein）后進入泛素化）后進入泛素化蛋白分解，故蛋白分解，故SmacSmac是線粒體內的第二個激活是線粒體內的第二個激活CaspaseCaspase的

22、因子的因子4 4SmacSmac二、影響線粒體膜通透性轉變的因素二、影響線粒體膜通透性轉變的因素（一）、（一）、BcL-2BcL-2族的促凋亡亞族成員族的促凋亡亞族成員1 1BadBad： 在生長因子存在下，可通過磷脂酰肌醇在生長因子存在下，可通過磷脂酰肌醇-3-3-激酶（激酶（phosphatidylinositol-3-kinasephosphatidylinositol-3-kinase，PI-3-KPI-3-K）和）和PKAPKA促使促使BadBad的的SerSer112112，136136磷酸化而抑制其促凋亡活性。磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生長因子時，則在去除生長因子時，則Ba

23、dBad被去磷酸化而與被去磷酸化而與Bcl-2Bcl-2或或Bcl-XBcl-XL L二聚化，破壞線粒體外膜通透性釋放出凋亡分二聚化，破壞線粒體外膜通透性釋放出凋亡分子而導致細胞凋亡。子而導致細胞凋亡。2 2BidBid： 本來存在于胞漿內，當被本來存在于胞漿內，當被Caspase 8Caspase 8催催化分裂成化分裂成N N端端11kD11kD和和C C端端15kD15kD二個片段，后者即轉位二個片段，后者即轉位線粒體破壞其外膜通透性而導致凋亡放大作用。線粒體破壞其外膜通透性而導致凋亡放大作用。3.Bim3.Bim： 本是結合在胞漿微管復合體，當受到凋本是結合在胞漿微管復合體，當受到凋亡刺

24、激時轉位到線粒體，中和亡刺激時轉位到線粒體，中和Bcl-2Bcl-2（或（或Bcl-XBcl-XL L）而導致凋亡。而導致凋亡。 PKC- PKC-與其它的與其它的PKCPKC成員（成員（PKC-PKC-，PKC-PKC-）的功）的功能不同。它一方面可直接作用改變線粒體膜的通透性導致能不同。它一方面可直接作用改變線粒體膜的通透性導致凋亡。另一方面凋亡。另一方面PKC-PKC-是是Caspase 3Caspase 3的靶底物，的靶底物，Caspase3Caspase3可催化可催化PKC-PKC-部分蛋白分解而增強激活，后者磷酸化并分部分蛋白分解而增強激活，后者磷酸化并分解核膜的層連蛋白（解核膜的

25、層連蛋白（LaminLamin）導致核膜破裂。故最近又將）導致核膜破裂。故最近又將PKC-PKC-稱為凋亡層連蛋白激酶（稱為凋亡層連蛋白激酶（apoptotic lamin apoptotic lamin kinasekinase）。）。 （二）、蛋白激酶（二）、蛋白激酶C-C-（PKC-PKC-）：）： 細胞內鈣離子濃度（細胞內鈣離子濃度（CaCa2+2+ i i）升高可激活胞漿）升高可激活胞漿內的鈣調磷酸酶（內的鈣調磷酸酶（CalcineurinCalcineurin），后者促使），后者促使BadBad去去磷酸化激活導致細胞凋亡。磷酸化激活導致細胞凋亡。（三）、（三）、CaCa2+2+ i

26、 i升高：升高： 在線粒體老化時，其呼吸鏈電子傳遞受損，在線粒體老化時，其呼吸鏈電子傳遞受損，產生活性氧（產生活性氧（reactive oxygen speciesreactive oxygen species，ROSROS）增多，破壞線粒體跨膜壓（增多，破壞線粒體跨膜壓（mm），增大線粒），增大線粒體膜通透性導致細胞凋亡。體膜通透性導致細胞凋亡。（四）、線粒體老化（四）、線粒體老化一、一、 生理性因子生理性因子（一）（一）p53p53 PTEN PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted phosphatase and tensin homolog

27、 deleted from chromosome 10from chromosome 10）是隨）是隨P53P53以后呈現最高突變率的以后呈現最高突變率的抑癌基因表達產物，它主要催化抑癌基因表達產物，它主要催化PI-3PI-3，4 4，5-P5-P3 3的肌醇的肌醇3 3位上去磷酸形成位上去磷酸形成PI-4PI-4，5-P5-P2 2，拮抗，拮抗PI-3KinasePI-3KinasePKB/AktPKB/Akt信號通路的抗凋亡作用。因為信號通路的抗凋亡作用。因為PKBPKB具有磷酸化抑具有磷酸化抑制制Caspase 9Caspase 9、BadBad的活性和抑制細胞色素的活性和抑制細胞色素C

28、 C的釋放與的釋放與FasFas介導的凋亡信號轉導，以及通過介導的凋亡信號轉導，以及通過FKHRFKHR間接抑制某些凋亡間接抑制某些凋亡因子基因表達等作用，因此具有很強的抗凋亡作用。因子基因表達等作用，因此具有很強的抗凋亡作用。（二（二 ）張力蛋白同源磷酸酯酶（張力蛋白同源磷酸酯酶（PTENPTEN） 現知現知PTENPTEN尚可延長細胞周期而減弱細胞增殖，以尚可延長細胞周期而減弱細胞增殖，以及通過去磷酸化抑制粘著斑激酶（及通過去磷酸化抑制粘著斑激酶（Focal adhesion Focal adhesion kinase,FAKkinase,FAK）而抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲，故）而抑制腫瘤

29、細胞的轉移和侵襲，故PTENPTEN與與P53P53一樣均一樣均屬于一類強效抑瘤因子屬于一類強效抑瘤因子，在許多腫瘤組織，在許多腫瘤組織中中PTENPTEN基因是呈現雜合子缺失的。基因是呈現雜合子缺失的。張力蛋白同源磷酸酯酶（張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）促凋亡機制）促凋亡機制病毒在感染宿主細胞后進行病毒分泌病毒在感染宿主細胞后進行病毒分泌(virocrine), (virocrine), 分泌的病毒因子中有些同源于細胞生長因子、生長因子受分泌的病毒因子中有些同源于細胞生長因子、生長因子受體或信號轉導分子，促進宿主細胞增殖和轉化，有些是阻體或信號轉導分子，促進宿主細胞增殖和轉化，有些是阻止宿

30、主細胞的凋亡防御，保護病毒的生存和免被消滅和清止宿主細胞的凋亡防御，保護病毒的生存和免被消滅和清除。除。1 1CrmACrmA（cytokine response modifier Acytokine response modifier A，細胞，細胞因子反應修飾因子因子反應修飾因子A A）。這是牛痘病毒分泌的一種蛋白質。這是牛痘病毒分泌的一種蛋白質因子，分子量因子，分子量38KD38KD，它具有抑制，它具有抑制Caspase3Caspase3和顆粒酶和顆粒酶B B（Granzyme BGranzyme B）活性而起到抗凋亡作用。）活性而起到抗凋亡作用。二、病毒因子二、病毒因子2 2P35:P

31、35:這是由桿狀病毒分泌的一種病毒因子，這是由桿狀病毒分泌的一種病毒因子，分子量分子量35KD35KD，其分子結構與，其分子結構與BcL-2BcL-2部分同源，故部分同源，故具有抑制凋亡的作用。具有抑制凋亡的作用。3 3EIB55KDEIB55KD和和EIB19KD:EIB19KD:均是腺病毒分泌的病毒因均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分別結合子，二者可分別結合P53P53和和FLASHFLASH而抑制細胞凋亡而抑制細胞凋亡。FLASHFLASH是最近報道的是最近報道的Pro-caspase-8Pro-caspase-8結合結合FADDFADD的的竟爭性抑制分子，故有抑制竟爭性抑制分子，故有抑制FasFas介導的凋亡作用介導的凋亡作用）。）。4 4HBX:HBX:是乙肝病毒（是乙肝病毒（HBVHBV）分泌的病毒因子，可結）分泌的病毒因子，可結合合P53P53，而抑制凋亡。，而抑制凋亡。5 5E6E6蛋白蛋白: :是人乳頭瘤病毒的分泌因子，可促進是人乳頭瘤病毒的分泌因子，可促進P53P53分解而抑制凋亡。分解而抑制凋亡。6 6LANA:LANA: 這是肉瘤皰疹病毒在感染潛伏期表達的這是肉瘤皰疹病毒在感染潛伏期表達的一種病毒因子，故特