1、實驗一 過氧化氫酶米氏常數的測定目的了解米氏常數的意義，測定過氧化氫酶的米氏常數。二、實驗原理H2O2被過氧化氫酶分解出 出0和02,未分解的H2O2用KMN0 4在酸性環境中滴定，根據反應前后 H2O2的濃度差可求出反應速度。gEH26 3Ha0+ j2 KMNO4+5 H2O+3 H2SO4 2MnSO4+5O2+8H2O本實驗以馬鈴薯提供過氧化氫酶，以 1/v 1/S作圖求Km三、實驗器材1. 錐形瓶 100150ml (X 6)。2. 吸管 1.0ml (X 2)、0.5ml (X 2)、2.0ml (X 2)、5ml (X 2)、10.0ml (X 1)。3. 溫度計(0100C)。

2、4微量滴定管5ml (X 1)。5.容量瓶 1000ml (X 1)。四、實驗試劑1、0.02mol/L 磷酸緩沖液(Ph7.0)取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1ml，用水稀釋至100ml, 即得。2、酶液：稱取馬鈴薯5g,加上述緩沖液10ml，勻漿，過濾。3、0.02mol/L KMnO4 :稱取 KMnO4(AR) 3.2g,加蒸餾水 1000ml，煮沸 15min， 2d后過濾，棕色瓶保存。4、0.004mol/L KMnO 4 :準確稱取恒重草酸鈉 0.2g，力卩250ml冷沸水及10ml濃硫酸，攪拌溶解，用0.02ml/L的KMnO 4滴定至微紅色，水浴

3、，加 熱至65 C,繼續滴定至溶液微紅色并 30s不褪，算出KMnO4的準確 濃度稀釋成0.004mol/L即可。5、0.05 mol/L H2O2:取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度（約0.2mol/L）,用標準KMnO4 （0.004mol/L）標定其準確濃度，稀釋成 0.05mol/L（標定前稀釋 4倍，取 2.0ml,力卩 25% H2SO42.0ml,用 0.004mol/LKMnO4滴定至微紅色）。6 25% H 2SO4五、操作取錐形瓶6只，按下表順序加入試劑：表一過氧化氫酶米氏常數的測定r管號試劑0123450.05mol/L H2O2/ml0

4、1.001.251.672.55.00蒸餾水/ml9.58.508.257.837.04.50酶液/ml0.50.50.50.50.50.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸餾水，加酶液后立即混合，依次記錄各瓶的起始反應 時間。各瓶時間達 5min時立即加2.0ml 25%硫酸終止反應，充分混勻。用 0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微紅色，記錄消耗的KMnO4體積 六、計算分別求出各瓶的底物濃度S和反應速度v。S=c iVi/10Cl? i C2 V »式中S:底物物質的量濃度（mol/L）；C1： H2O2物質的量濃度（mol/L）；V1: H2O2

5、體積（ml）；10：反應的總體積（ml）；u :反應速度（ m mol/min ）;C2： KMnO4物質的量濃度（mol/L）;V2: KMnO4體積（ml）;以1/u對1/S作圖求出Km實驗二 酶促反應中初速度時間范圍測定一、實驗目的1. 了解酶促反應中初速度時間范圍測定的基本原理；2. 掌握酶促反應中初速度時間范圍的測定方法。二、實驗原理酸性磷酸酯酶( acid phosphatase, EC 3.1.3.2 )廣泛分布于動植物體中， 尤其是植物的種子、 動物肝臟和人體的前列腺中。 它對生物體內核苷酸、 磷蛋白 和磷脂的代謝起著重要作用。酸性磷酸酯酶能專一性水解磷酸單酯鍵。以人工合成的對

6、硝基苯磷酸酯(4-nitrophenylphosphate, NPP作底物，水解產生對硝基苯酚和磷酸。在堿性溶液中，對硝基酚的鹽離子于 405nm處光吸收強烈，而底物沒有這種特性。利用產物的這種特性， 可以定量的測定產物的生成量， 從而求得酶的活力單 位。即通過測定單位時間內 405nm處光吸收值的變化來確定酸性磷酸酯酶的活 性。酸性磷酸酯酶的一個活力單位是指在酶反應的最適條件下，每分鐘生成1卩mol 產物所需的酶量。要進行酶活力測定， 首先要確定酶反應時間。 而酶的反應時間應該在初速度 時間范圍內選擇。 可以通過進程曲線的制作來求出酶的初速度時間范圍。 進程曲 線的制作是指在酶反應的最適條件

7、下， 采用每隔一定時間測定產物生成量， 以酶 反應時間為橫坐標， 產物生成量為縱坐標繪制而成。 從進程曲線可知， 在曲線起 始的一段時間內為直線， 其斜率代表初速度。 隨著反應時間的延長， 曲線趨于平 坦，斜率變小，反應速度下降。要真實反映出酶活力大小，就應在初速度時間內 測定。三、實驗試劑與器材1. 試劑(1) 酸性磷酸酯酶原液(從綠豆芽中提取)( 2)酸性磷酸酯酶液(通過原酶液稀釋得到)取原酶液，用 0.05mol/L 、pH5.0 檸檬酸鹽緩沖液稀釋，使進程曲線中第 11號管吸光度Aw5在0.60.7之間。(3) 1.2mmol/L對硝基苯磷酸酯精確稱取NPP0.4454g加緩沖液定容至

8、100mL(4) 0.3mol/LNaOH溶液2. 器材恒溫水浴槽，可見分光光度計，試管，刻度吸管，離心機。四、操作步驟1. 酸性磷酸酯酶原酶液的制備稱取一定重量的綠豆，浸泡 24h，在2530° C溫箱中培養57d。長出的 豆芽取其頸部，依次用自來水和重蒸水沖洗干凈，置濾紙上吸干水分，稱30g放 入研缽中勻漿，加0.2mol/L乙酸鹽緩沖液4mL置4° C冰箱中6h以上。然后 用雙層紗布擠壓過濾，濾液 6000r/min離心15min,上清液置透析袋用蒸餾水充 分透析，間隔換水10次，透析24h以上。將透析后酶液稀釋至最終體積與豆芽 質量(g)相等，以6000r/min離

9、心30min，所得上清液即為原酶液，置冰箱待 用。2. 酶促反應取試管12支，按表1.1編號，0號為空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP; 另外2支試管，各加入稀釋好的酶液7mL在酶反應前底物與酶都放入35° C恒 溫水浴槽中預熱2min。然后向111號管內各加入1.0mL預熱的酶液。立即搖 勻并開始計時。按時間間隔為 3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、 25min、30min、40min、50min進行反應。待反應進行到上述各相應時間時，加 入3.0mL 0.3mol/L NaOr終止反應。冷卻后以0號管作空白(0號管加入1.0

10、mL NPP 后保溫25min,然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH再加入1.0mL酶液)，在分光光 度計上測定各管A405值。3. 數據處理以反應時間為橫坐標，幾05值為縱坐標繪制進程曲線。由進程曲線中直線部 分求出酸性磷酸酯酶反應初速度的時間范圍。表1.1 制作酶促反應進程曲線時各物質加入量試管號12345678910110NPP( mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0稀釋酶液(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0反應時間(min)3571012152025304050250. 3MNaOH(mL

11、)3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0五、實驗報告繪出酶促反應進程曲線，記錄實驗結果，計算酸性磷酸酯酶反應初速度的時間范圍實驗三 酵母蔗糖酶的部分純化與酶活測定一、目的： 了解酶的純化方法。二、原理：酵母中含有豐富的蔗糖酶(EC.321.26)，本實驗以酵母為原料，通過破碎細 胞方式得到粗酶，并用熱變性法除雜蛋白純化。 (請參考相關教材)三、試劑與儀器1 、試劑與材料：(1) 干酵母(2) 石英砂(3) 1 mol/L 醋酸溶液(4) 2 mol/L 氫氧化鈉溶液(5) 醋酸緩沖液( pH 4.6)(6) 5% 蔗糖溶液DNS( 3,5-二硝基水楊酸)試劑2

12、、儀器： 電子天平、離心機、分光光度計、水浴鍋、電爐、研缽、試管、三角瓶、量筒、 移液管。四、操作方法1 、破碎細胞取2 g干酵母于研缽中，加入2 g石英砂，加30 ml去離子水，研磨15 min, 放入冰箱冷凍室(-20 C)冰凍約20 min (研磨液面上剛出現冰結為宜)。取出冷凍酵母，再研磨 5 min 后，在 5000 r/min 條件下離心 12 min ，小心 取出上清液(組分一)并量出體積 Vi,分別取0.5 ml上清液到試管A B中，余 者倒入三角瓶。2、純化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液調pH 5.0 （試紙）。然后迅速放入 到55 C的水浴中，保溫30 min。

13、之后在冰浴中迅速冷卻。在 5000 r/min條件 下離心12 min。取出上清液（組分二）并量出體積 V2，分別取0.5 ml上清液到 試管C、D中。3、酶反應取四支試管，分別按順序加入反應物:試呂編號酶液氫氧化鈉溶液醋酸緩沖液蔗糖溶液A （對照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlB0.5 ml-2 ml1 mlC （對照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlD0.5 ml-2 ml1 ml試管中反應物在55 °C水浴中反應5 min （秒表計時）后，B、D管立即各加 入1 ml氫氧化鈉溶液（2 mol/L）終止反應，A、C管中各加入1 ml蒸餾水。4、酶催化產物檢測取5支試

14、管，分別加入反應物:試呂編號反應液DNS試齊U10.5 ml A0.5 ml20.5 ml B0.5 ml30.5 ml C0.5 ml40.5 ml D0.5 ml5 （空白）0.5 ml 蒸餾水0.5 ml試管中反應物在沸水浴中反應5 min，然后冷卻。加入4 ml蒸餾水。將各試管搖勻，用空白管溶液（5號管）調零點，測定它們的吸光度值 A540。五、結果計算1、酶活力單位的定義：本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在55C條件下，每1 min催化底物轉化為1 mg還原糖的酶量。2、酶活計算:粗酶的計算酶活（組分一）(Babs-Aabs)54.505純化后酶的計算酶活（組分二）5(Dabs 一 Ca

15、bs)匯 4 X 54540.53、總酶活的計算:總酶活1 （組分一，粗酶）：計算酶活x稀釋倍數疋丿總酶活2 （組分二，純化后酶）：計算酶活污釋倍數劇4、酶活回收率的計算:酶活回收率=總酶活2100%附：還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同， 可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解 成有還原性的單糖進行測定，再分別求岀樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄

16、糖含量計）。還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的 3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求岀樣品中還原糖和總糖的含量。實驗四 蔗糖酶包埋及固定化酶活測定、目的：了解凝膠包埋法及固定化酶活測定方法。、原理：海藻酸鈉在遇到Ca2+時成膠，從而把酶包埋在其中。（請參考相關教材）三、試劑與儀器1、試劑與材料：（8）干酵母（9）海藻酸鈉(10)無水氯化鈣(11)5% 蔗糖溶液(12)DNS（ 3,5-二硝基水楊酸）試劑2、儀器：電子天平、分

17、光光度計、水浴鍋、電爐、燒杯、玻棒、量筒、試管、量筒、移液管、注射器（帶 7 號針頭）、紗布。四、操作方法4、配 A 液取0.75 g海藻酸鈉溶在25 ml蒸餾水中，沸水浴（勿用電爐直接加熱）充分 溶脹。自然冷卻。5、配 B 液取 1 g 干酵母溶在 25 ml 蒸餾水中（室溫），攪勻。6配C液A液冷卻后，將B液倒入其中，攪勻。4、配 CaCl2液取2.2 g無水CaCl2溶于200 ml蒸餾水中。5、制備膠珠用注射器（7號針頭）將C液滴入CaCI2溶液，滴時不斷攪拌溶液。靜置20 min, 固化膠珠。紗布過濾得到膠珠，用蒸餾水清洗膠珠，稱取濕膠珠質量（ W1 , 并記錄。6催化取1 g濕膠珠

18、置于燒杯中，加入20 ml 5%蔗糖溶液，37 °C反應10 min，取出 反應液，與膠珠分離，反應終止。7、酶催化產物檢測將反應液定容至20 ml，取0.5 ml稀釋至5 ml，得D液。取2支試管，分別加入反應物：試呂編號反應液DNS試齊U10.5 ml D0.5 ml2 （空白）0.5 ml 蒸餾水0.5 ml試管中反應物在沸水浴中反應 5 min，然后冷卻。加入4 ml蒸餾水。將各試管搖勻，用空白管溶液調零點，測定它們的吸光度值A54O五、結果計算5、酶活力單位的定義：本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在 37C條件下，每1 min催化得到1 mg還原糖所需酶量。5 20100.5

19、0.56酶活計算：1 g固化酶酶活:六、思考題1、海藻酸鈣包埋法中鈣起什么作用？與豆腐制作中 Ca2+的作用有何關系?2、除了凝膠包埋法，還有哪些包埋方法？其原理是什么？實驗五 尼龍固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共價交聯法固定酶的原理和步驟二、原理尼龍是聚酰胺物質，經HCI水解后暴露出游離NH2 NH2與戊二醛反應，尼 龍即成活化載體，可與酶表面 NH2反應，把酶連在尼龍上。三、實驗材料、儀器和試劑1、材料尼龍布(86或66)，140目，剪成3cm 3cm2、儀器(1) 恒溫水浴鍋 (2) 紫外分光光度計 (3) 冰箱3、試劑(I) 18.6%CaCI 2溶液(2) 甲醇溶液 (3)3.65m

20、oI/LHCI 溶液(4) 0.2moI/L 硼酸緩沖液 (pH 值 8.5)(5) 5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸緩沖液配制，pH值8.5(6) 0.1moI/L 磷酸緩沖液 (pH 值 7.8)(7)1mg/mL 木瓜蛋白酶溶液(8) 0.5mol/L NaCl 溶液(9)0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH 值 7.2)(10) 激活劑：用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、 1mmol/LEDTA勺混合液。(II) 0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制。(12) 10%三氯乙酸(TCA)溶液。四、操作步驟1

21、、固定化酶勺制備(1)每組取5塊尼龍布洗凈、晾干，浸入含18.6%CaC2溶液10s，再浸入18.6% 水勺甲醇溶液中，輕輕攪拌 5min 以上至尼龍發粘。取出后用水洗滌，用濾紙吸 干。 將尼龍布用3.65mol/L HCI溶液在室溫下水解45min,用水洗至pH值中性(pH 試紙檢測)。(3) 將尼龍布用 5%戊二醛溶液在室溫下浸泡偶聯 20min。(4) 取出尼龍布，用 0.1mol/L 磷酸緩沖液 (pH 值7.8) 洗滌 3次，洗去多余勺戊 二醛，吸干之后，加入 5ml 1mg/mL 勺木瓜蛋白酶液，在室溫下固定 30min。(5) 從酶液中取出尼龍布，用 0.5mol/L NaCl

22、溶液(用 0.1mol/L 磷酸緩沖液 (pH 值 7.2) 配制)，洗去多余勺酶蛋白，即為尼龍固定化酶。2、酶活力測定A. 0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活劑+1ml酪蛋白液B. 0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活劑+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液C. 固定化酶一張(剪碎)+2.0ml激活劑+1ml酪蛋白液取三支試管按上述加入反應液，37C反應15min, A C+2ml 10%E氯乙酸。三支試管過濾上清液到另三支試管中，以B管作空白，測試管A、C吸光值(280nm 紫外)五、結果計算1. 酶活定義：每15min增加0.001個消光值所需酶量為1個酶活單位。固定化酶活 52.

23、酶活回收=100%溶液酶活x5/0.2六、注意事項(1)尼龍布的處理是本實驗成敗的關鍵，既要讓其充分地活化，又不能使其破碎。 固定化酶溶液濃度最好為0.51mg/mL對每塊尼龍布用量不宜超過 0.8mL。(3)酶活性測定的反應時間一定要準確。實驗六、產淀粉酶菌株的快速篩選一、目的學習和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和篩選方法。二、原理產淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周圍的培養基中，從而水解培養基中的淀粉，由于使用的是經活性染料標記的帶顏色的淀粉（本實驗為RBV-淀粉，呈鮮艷的紫紅色）當其被淀粉酶作用后便形成可溶，且較易擴散的小分水解物，從而在該菌落周圍形成顏 色較淺的透明圈。而透明圈直徑與菌落直

24、徑之比則可反應菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、簡單易行等優點。圖1產淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、試劑和儀器1、菌的來源取不同地點的表層土壤。2、試劑：RBV-Starch （Sigma）, NaNO 3, K2HPO4, MgSO4, KCI, 2 mol/L NaOH無菌水和瓊脂粉等。3、器皿250mL三角瓶兩個 、9.0cm培養皿若干、涂布棒、 200山移液槍、200止槍頭若干、牙簽若干、指形管若干、10mL具塞刻度試管四支、滴管四支、取樣器和塑料直尺等。4、儀器設備高壓消毒鍋、恒溫通氣式培養箱、搖床、離心機、電子天平等。四、實驗操作步驟1、器皿的消毒：培養皿、槍頭、牙簽、指形

25、管、塞刻度試管、滴管四支等用四層報紙包好，在121 C下滅菌 20 min ，取出備用。2、培養基的配制與滅菌培養基的組成為： RBV- 淀粉(1.2 %, w/v )， NaNO 3(0.2%, w/v), K 2HPO 4( 0.2 %, w/v) , MgSO 4 7H 2O (0.1%, w/v ) , KCI(0.1%, w/v), 瓊脂(2% , w/v ),調 PH 至 6.0 左右。 在 三角瓶中，121 C滅菌20 min，將滅菌后的培養基倒入培養皿，每皿大約15mL，靜置凝固備用。( 倒平板之前務必將培養基搖晃均勻，以避免標記的RBV- 淀粉在培養基中分布不均勻， 影響菌落的觀察。 )3、土樣的采集及稀釋于校園等不同地點采集土壤樣品； 取樣時， 用取樣器向下打取 1cm 左右深度的土樣， 將從各個地點取得的土樣混合；取樣點最好選擇有機質豐富的地方。4、富集稱取 5.0 g 混合土樣和 0.5 g 的淀粉混合，并加入適量的蒸餾水使其濕潤，置于培養 皿中富集培養 24h