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8、, 其質量問題主要源于細胞自身和外源污染物。經充分鑒定的細胞庫不僅可以使產品始終有一個恒定的細胞來源, 還能減少被其他細胞系和外源物質污染的可能性。建庫細胞的質量控制內容包括細胞鑒定以及內源和外源性微生物污染(細菌、真菌、支原體和病毒 的檢測。對于生產重組DN A 產品的細胞, 在核酸水平(遺傳穩定性 對表達構建物進行分析也是一個主要問題。有關建庫細胞安全性檢測計劃的制訂策略應當基于正確的科學原理和現行的管理指南。【關鍵詞】細胞庫; 生物技術產品【中圖分類號】R 392-33【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-4211(2006 06-0251-041二級細胞庫系統的概念1999年, Ha

9、yflick 在關于疫苗研發用細胞基質的研究進展報告中介紹了主細胞庫(M CB 和工作細胞庫(WCB 概念的起源。1963年的一次會議上, 細胞培養委員會的分委會國際生物制品協會微念。Hay flick 建議應像制備病毒種子的系統一樣運用二級細胞庫系統(MCB 和WCB 。早在20世紀80年代初, 這個概念就用于嚙齒動物細胞系, 如中國倉鼠卵巢細胞(CHO 和小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0和NS0 , 從而為生物制品生產的質量控制奠定了基251國際生物制品學雜志2006年12月第29卷第6期Int J Biolog icals, Decemb er 2006, Vol 29, No. 6生物技術(

10、尤其是重組DNA 產品 的快速發展, 要求管理機構制定指南和考慮要點(Po ints to Consider 文件來確保這些產品的質量和安全性。關于二級細胞庫系統, 美國FDA 生物制品評價和研究中心(CBER 的考慮要點(CBER /FDA , 1993; CBER/FDA, 1997 、歐洲委員會的指南(CPM P/BWP/5271/94, 1995 以及國際協調會議(ICH 指南(ICH Q5D, 1998 已經提出了用于生產生物制品的細胞庫的制備和鑒定的適當標準。ICH 指南中的一些建議為生產生物制品的哺乳動物細胞基質的質量控制提供了全面的方法。2細胞庫的建立防止微生物污染的細胞基質進

11、入現行藥品生產質量管理規范(cGM P 的生產設施十分重要。在制備cGM P MCB 和WCB 之前, 所有細胞種子和細胞基質在發放前都應該接受無菌試驗(細菌和真菌 和支原體檢查。細菌和真菌的檢測應按美國或歐洲藥典的要求進行。支原體的檢測應當使用包括瓊脂和肉湯培養基的方法以及指示細胞培養程序。這些方法在FDA /CBER 生物制品用細胞系鑒定的考慮要點(CBER/FDA , 1993 中已有描述。ICH 文件Q5D 對一級或二級細胞庫系統的概念進行了描述。所謂一級細胞庫系統, 是指只建立M CB 而沒有WCB 。如果產品每年生產只需少量細胞, 可以使用一級細胞庫系統。二級細胞庫系統是指先建立M

12、 CB , 再用其生產WCB 。用于生產經重組DNA 修飾的細胞的親本細胞系, 歷史背景是否清晰對于生物制品的開發十分重要。一般從聲譽好的來源實驗室, 如美國標準菌種保藏中心和歐洲細胞培養物保藏中心獲取親本細胞。一旦從細胞保藏機構獲得了細胞系, 科學家們就會利用遺傳工程技術復制出多拷貝目的基因, 生產大量蛋白質。選擇恰當的細胞基質, 可以免去為得到預期的分子特性所需的額外處理步驟, 因為這些細胞可以完成蛋白質翻譯后的修飾(蛋白質糖基化和折疊成預期的構象 。細胞基質確定后, 就要建立M CB 。M CB 是指來自相同的選擇性克隆, 在特定條件下制備后分裝于多個安瓶中, 并保存于特定條件下(通常為

13、-100以下 的同一批次細胞。生產過程中通常采用由M CB 傳建的WCB , 但也可直接使用MCB 。通常M CB (100瓶, 每瓶107個細胞 和WCB(100500瓶 是在護劑的細胞在特定條件下冷凍, 細胞庫分別存放在可監測的液氮罐中。為了保證不受污染, 在制備細胞庫期間應啟動環境監測程序。經過充分鑒定的細胞庫系統具有如下優點:(1 對建庫的細胞基質的鑒定和檢測可證實其特性、純度和生產適用性; (2 用于生產生物制品的建庫細胞能提供穩定的來源, 并且保證有充足的同質細胞滿足產品的需要。3建庫細胞基質的質量控制應當對M CB 進行全面鑒定和檢測, 包括細菌、真菌、支原體以及內源和外源性病毒

14、在內的污染微生物。由于W CB 是由M CB 在嚴格質控下傳代而來, 因此只需檢測外源因子(細菌、真菌、支原體和病毒 。對體外最高代次(生產結束 細胞亦需評價, 以確保在生產過程中沒有引入的外源因子。上述鑒定應使用普遍敏感的檢測系統與特異性檢測試驗(針對與待檢細胞有特定聯系的感染因子 相結合的方法。治療用生物制品生產中使用的生物原材料是外源因子污染的主要來源。近年來, 為了規避這些風險, 制造商已轉向使用無血清、無蛋白培養基。然而, 仍有少數獲得批準的生物制品使用胎牛血清作為培養基的補充成分。當建庫和生產培養基使用胎牛血清作為細胞培養添加物時, 應注意確保血清經過輻照并且來自無牛海綿狀腦病(B

15、SE 的地區。如果在生產中有必要使用牛源性原材料(如血清、轉鐵蛋白、白蛋白和胰島素 , 應建立檢定程序, 檢測病毒和其他外源因子。3. 1原材料的檢定作為細胞培養添加物的動物源性原材料應該進行細菌、真菌、支原體和病毒的檢測。關于BSE 傳播問題, 供應商應提供動物提取物無BSE 因子的證明。3. 1. 1支原體支原體的檢測是由Chen 等首先提出的。FDA /CBER 的考慮要點文件(CBER /FDA , 1993 和歐洲藥典(2003 也提出應當進行支原體檢測。并要求在固體和液體培養基中培養, 以及在敏感細胞系(Vero 或與其相當的指示細胞基質, 如NIH -3T3 中培養后進行DNA

16、染色分析。3. 1. 2牛源性病毒檢測用于細胞傳代的牛血清應不含有傳染性病毒。但供應商提供的檢測證明未必反映真實的歷史, 因此需要通過驗證和對供貨商所描述的資料進行審核, 從而對來源進行確證。, 252國際生物制品學雜志2006年12月第29卷第6期In t J Biologicals, December 2006, Vol 29, No. 62004 和歐盟(CPM P /BWP /1793/02 要求至少選擇兩個不同的細胞系, Vero 細胞和一個牛源性細胞系(如牛鼻甲骨 。這些細胞系應該能夠檢測出血細胞吸附病毒和致細胞病變因子。也可使用熒光抗體技術來檢測病毒。美國FDA 和歐盟指南中要求

17、檢測的牛源性病毒包括牛病毒性腹瀉病毒、藍舌病毒、牛腺病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛細小病毒、3型呼腸病毒、狂犬病病毒。除這些病毒外, 還推薦采用PCR 方法檢測經常污染牛血清的牛多瘤病毒。3. 2M CB 的鑒定和檢測微生物和細胞污染物檢測是確保生物制品生產的細胞庫合格的一項重要內容。通常參照ICH 指南(ICH Q 5A; ICH Q 5D 和FDA/CBER 考慮要點中的建議來檢測生物技術產品生產用MCB 。應設計一套檢測項目全面檢測微生物污染狀況, 并對細胞系進行鑒定(表1 。這種針對M CB 特性和純度的全面檢測只需進行一次。表1M CB 的鑒定和檢測哺乳動物細胞系, 如NS0細胞支原體(

18、FDA/CBER, 1993和歐洲藥典細菌/真菌抑制檢測(USP 27無菌試驗(細菌和真菌 (USP 27外源病毒的體內檢測組織培養安全性試驗(外源病毒的體外檢測同工酶分析透射電鏡檢查抗體產生試驗逆轉錄病毒檢測(逆轉錄酶、S +L -灶、XC 蝕斑牛源和豬源病毒(只有使用牛和豬的原料時M CB 應不含任何外源因子。已知嚙齒動物的細胞能表達內源性病毒(如逆轉錄病毒 。因此, 應該進行內源性病毒檢測并報告檢測結果。應通過抗體產生試驗來檢測存在于嚙齒動物(小鼠、倉鼠、大鼠 細胞中的種屬特異性病毒?？梢酝ㄟ^PCR 試驗來檢測人細胞系中的病毒。盡管仍需對二倍體細胞系進行染色體特性分析, 但不再建議對傳代

19、細胞系, 尤其是嚙齒動物細胞系(如Sp2/0、NS0、CHO 進行細胞核學檢測, 只要求進行同工酶檢測。因為已有這些細胞致瘤性的文獻資料, 故對于嚙齒動物來源的傳代細胞系不需要進行致瘤性試驗。3. 2. 1病毒的體外檢測(組織培養安全性試驗 應將細胞溶解產物接種到能檢測多種病毒的指示細系(Vero 以及在種屬和組織類型上與用于生產的細胞相同的細胞。可以根據細胞來源, 傳代史和細胞培養基中使用的原材料來選擇其他指示細胞。培養14或28天, 觀察有無細胞病變, 檢測血細胞吸附和血細胞凝集(這些現象提示有病毒污染 。在特定條件下, 為了鑒別某些病毒, 如人巨細胞病毒, 可以延長觀察期至28天。3.

20、2. 2隱匿性病毒檢測的體內試驗通過接種乳鼠、成年小鼠、豚鼠和雞胚來檢測細胞培養物中檢測不到的隱性病毒(組織培養試驗 。體內病毒分析是用來檢測各種外源病毒, 而不是用來確認特殊致病因子的。FDA 和歐洲的要求有些不同。主要區別是:美國要求使用成年小鼠, 并且FDA 要求通過兩種途徑接種雞胚(尿囊腔和卵黃囊 , 而歐洲要求三種途徑(尿囊腔、卵黃囊和絨毛尿囊膜 。孵育結束后, 用豚鼠和雞紅細胞檢測尿囊液中是否存在血凝素。3. 2. 3逆轉錄病毒試驗逆轉錄病毒試驗應包括感染性檢測、逆轉錄酶(RT 檢測和透射電鏡觀察。對于嚙齒動物細胞系, 根據不同的情況可選擇多種感染性檢測方法。對于親嗜性和異嗜性病毒

21、, 可以通過兩種方式來檢測逆轉錄病毒:其中XC 蝕斑試驗是以XC 作為指示細胞, 觀察是否形成蝕斑來檢測親嗜性病毒; 水貂細胞S +L -試驗可用于檢測異嗜性病毒污染。當鼠源性逆轉錄病毒水平較低時, 可以通過與易感細胞系(如M us dunni 細胞 共培養來進行擴增。RT 試驗是通過檢測RT 活性來判斷細胞外是否存在逆轉錄病毒顆粒。這種檢測方法的原理是以人工合成的寡核苷酸為模板, 在RT 的作用下將放射性標記的核苷酸聚合成互補DNA (cDNA 。哺乳動物C 型逆轉錄病毒偏愛二價錳離子, 而B 、D 型逆轉錄病毒和慢病毒屬偏愛鎂離子。由于各種酶(包括細胞DNA 聚合酶 都能使標記的脫氧核苷酸

22、摻入到非酸溶性物質中, 所以這種方法可能存在假陽性。由于細胞DN A 聚合酶和病毒RT 對于模板的選擇性不同, 通過比較來自DNA 模板和RNA 模板的結果可以消除假陽性。也可以使用基于RT 的PCR 方法, 這種檢測方法比上述標準的酶活性RT 方法更靈敏, 但需要謹慎解釋試驗結果。因為并非逆轉錄病毒獨有RT 活性, RT 活性還有其他來源, 例如不能編碼完整基因組或細胞DNA 聚合酶的逆轉錄病毒樣元件。253國際生物制品學雜志2006年12月第29卷第6期Int J Biolog icals, Decemb er 2006, Vol 29, No. 6學特征以及病毒和病毒樣顆粒的存在(A 、

23、B 、C 、D 和R 型 。多數嚙齒動物細胞(如小鼠雜交瘤、NS 0、Sp2/0和CHO 可以表達由細胞膜芽生或者處于細胞外的C 型顆粒以及腦池內A 型顆粒。但是, BH K 細胞可表達低水平的腦池內R 型顆粒。3. 2. 4選擇性病毒的檢測用抗體產生試驗檢測可能存在于嚙齒動物細胞基質中的種屬特異性病毒, 小鼠抗體產生試驗可檢測16種鼠病毒, 倉鼠抗體產生試驗可檢測5種病毒, 大鼠抗體產生試驗可檢測9種病毒(ICH Q 5A 。試驗過程如下:通過不同途徑(口、鼻、腹腔和顱內 將供試物接種到無病毒動物體內, 在規定時間后檢測血清抗體水平。淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCM V 的體內檢測包括顱內

24、接種后再進行LCM V 攻擊。使用適當的體外試驗或PCR 分析可以檢查人源細胞基質中是否存在人源病毒致病因子, 如EB 病毒、巨細胞病毒、人逆轉錄病毒(人嗜T 淋巴細胞病毒和人免疫缺陷病毒 、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、6和7型人皰疹病毒、細小病毒B 19、多瘤病毒屬(JC 病毒和BK 病毒 和16和18型人乳頭狀瘤病毒。3. 3WCB 的鑒定和檢測由于WCB 來源于M CB 且培養時只傳幾代, 故僅需對外源因子進行有限的檢測。提議只采用以下試驗對WCB 進行一次鑒定:無菌試驗、支原體檢查、同工酶分析和組織培養安全性試驗。3. 4生產結束細胞或體外最高代次細胞的檢定生產細胞通常通過擴增WCB

25、獲得。在生產結束時, 應該評估這些細胞(生產結束或體外最高代次 是否存在M CB 中未檢測到的內源性病毒以及在生產過程中是否引入污染物。對這些細胞只需進行一次鑒定。只有當啟用新的WCB 、改變細胞培養基或擴大生產規模的情況下, 才有必要進行再檢驗。3. 5細胞基質的遺傳穩定性細胞基質穩定性的主要問題是能否持續穩定地生產重組DNA 蛋白和在特定條件下貯存時仍保留生產的能力。故應對比分析生產細胞(M CB 和體外最高代次細胞(生產結束細胞, EPC 的遺傳穩定性。應驗證表達構建物中編碼重組蛋白序列的正確性。從樣本DNA 中PCR 擴增的DNA 或由供試物(M CB 和EPC 分離的RNA 制備的cDNA 用于進行DNA 序列分析。通過限制性內切酶譜和DNA 印跡試驗來檢測基因表達質粒的完整性, 以確定質粒的拷貝數, 并檢測是否有大的序列插入或缺失。參考文獻1S chiff LJ. Review :pr od uction, char acterization, and testing of bank ed mammalian cell su bstrates used to produce biological produ cts. In Vitro Cell Dev Biol Anim , 2005, 41(3-4 :65