1、1本章主要內容本章主要內容一、一、DNADNA的半保留復制的半保留復制二、二、DNADNA復制的起點與方向復制的起點與方向三、三、DNADNA的半不連續復制的半不連續復制四、與四、與DNA DNA 復制有關的蛋白質復制有關的蛋白質五、大腸桿菌五、大腸桿菌DNADNA的復制過程的復制過程六、復制起始的時序控制六、復制起始的時序控制七、真核生物七、真核生物DNADNA復制特點復制特點八、八、DNADNA損傷的修復損傷的修復目的要求目的要求第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復2 1. 掌握遺傳信息傳遞的中心法則。掌握遺傳信息傳遞的中心法則。 2. 掌握掌握DNA復制的一般規律：復制的一般規律

2、：DNA的半保留復制、的半保留復制、 DNA的半不連續復制的概念。的半不連續復制的概念。 3. 了解三種大腸桿菌了解三種大腸桿菌DNA聚合酶的催化特性及其功聚合酶的催化特性及其功 用；了解原核生物用；了解原核生物DNA的復制過程。的復制過程。 4. 了解使了解使DNA損傷的因素；損傷的因素；DNA損傷的修復機制：損傷的修復機制： 錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復、直接修錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復、直接修 復、重組修復及傾向差錯的修復的過程及過程所需要復、重組修復及傾向差錯的修復的過程及過程所需要 的酶類；了解的酶類；了解DNA損傷修復的意義。損傷修復的意義。目的要求目的要求第

3、第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復31964-1970 1964-1970 發現勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉錄發現勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉錄 19531953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick提出中心法則：遺傳信息的單向流動。提出中心法則：遺傳信息的單向流動。 中心法則：中心法則：病毒（復制）病毒（復制）復制復制轉錄轉錄DNA RNA 蛋白質蛋白質翻譯逆轉錄逆轉錄RNARNA的復制存在于的復制存在于RNARNA病毒病毒 DNA DNA是生物遺傳的主要物質基礎，生物機體的遺傳信息以密是生物遺傳的主要物質基礎，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在碼

4、的形式編碼在DNADNA分子上，表現為特定的核苷酸排列順序，分子上，表現為特定的核苷酸排列順序，并通過并通過DNADNA的復制由親代傳遞給子代。在后代的生長發育過程的復制由親代傳遞給子代。在后代的生長發育過程中，遺傳信息自中，遺傳信息自DNADNA轉錄給轉錄給RNA,RNA,然后翻譯成特異的蛋白質，以然后翻譯成特異的蛋白質，以執行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。執行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復4Reverse transcription中心法則圖示中心法則圖示5 復制：復制：以親代以親代DNADNA或或RNARNA

5、為模板，根據為模板，根據堿基配對堿基配對的原則的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代的子代DNADNA或或RNARNA的過程。的過程。幾個基本概念：幾個基本概念： 逆轉錄：逆轉錄：以以RNARNA為模板，在為模板，在逆轉錄酶逆轉錄酶的作用下，的作用下，生成生成DNADNA的過程。的過程。 翻譯：翻譯：亦叫轉譯，以亦叫轉譯，以mRNAmRNA為模板，將為模板，將mRNAmRNA的密的密碼解讀成蛋白質的碼解讀成蛋白質的氨基酸順序氨基酸順序的過程。的過程。 轉錄：轉錄：以以DNADNA為模板，按照堿基配對原則合成為模板，按照堿基配對原則合成RNARNA，

6、即將，即將DNADNA所含的遺傳信息傳給所含的遺傳信息傳給RNARNA，形成一，形成一條條與與DNADNA鏈互補的鏈互補的RNARNA的過程。的過程。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復6一、一、DNADNA的半保留復制的半保留復制2.2.半保留復制的實驗證據半保留復制的實驗證據: :1.1.定義：定義： 1958 1958年年MeselsonMeselson和和StahlStahl用同位素用同位素1515N N標記標記大大腸桿菌腸桿菌DNADNA, ,首先證明了首先證明了DNADNA的半保留復制。的半保留復制。 以以親代親代DNADNA雙鏈雙鏈為模板以為模板以堿基互補堿基互補方式合成

7、子方式合成子代代DNADNA，這樣新形成的子代，這樣新形成的子代DNADNA中，一條鏈來自親中，一條鏈來自親代代DNADNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式叫式叫半保留復制半保留復制。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復7Testing Models for DNA replicationMatthew Meselson and Franklin Stahl (1958)89DNADNA復復制的可制的可能方式能方式全保留與全保留與全新復制全新復制分散復制分散復制半保留半保留復制復制10DNADNA半保留復制圖示：半保留復制圖示：11 半保留復制

8、的證明：半保留復制的證明： Meselson Meselson 和和StahlStahl將同位素將同位素1515N N標記的標記的1515NHNH4 4ClCl加入大腸桿菌的培養基中培養加入大腸桿菌的培養基中培養1212代，代，使大腸桿菌的使大腸桿菌的DNADNA都帶上都帶上1515N N的標記，然后的標記，然后將該大腸桿菌轉入將該大腸桿菌轉入1414N N的普通培養基中培養的普通培養基中培養后，分離子一代、子二代、子三代、子四后，分離子一代、子二代、子三代、子四代代DNADNA，進行，進行氯化銫氯化銫密度梯度離心，實驗密度梯度離心，實驗證明了證明了DNADNA的半保留復制。的半保留復制。第第

9、34章章 DNA的復制和修復的復制和修復12131515N-DNAN-DNA的密度大于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度14親代親代DNADNA（1515N N1515N N）子一代子一代DNADNA（1515N N1414N N）子二代子二代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:1)N 1:1)子三代子三代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:3)N 1:3)子四代子四代DNA (DNA (1515N N1414N N，1414N N1414N 1:7 )N 1:7 )親代親代DNADNA與子

10、二代與子二代DNADNA的混合物的混合物親代親代DNADNA與子四代與子四代DNADNA的混合物的混合物15復制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖復制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Cairns實驗實驗) 將將3H-胸苷標記大腸桿菌胸苷標記大腸桿菌DNA，經過，經過近近兩代兩代的時間，的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌胸苷摻入大腸桿菌DNA 。用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體。用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復制部分（放射自顯影，得到上圖。非復制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非

11、放射性鏈構成。已復制部分占整個染色體的三分之二，其中一條雙和一股非放射性鏈構成。已復制部分占整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（鏈（ B ）僅有一股鏈是標記的，另外一股雙鏈（）僅有一股鏈是標記的，另外一股雙鏈（ A ）的兩股鏈都是標記的，）的兩股鏈都是標記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。微米。ABC環狀環狀DNA的復制的復制 ABC16復制中的大腸桿菌染色復制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖體放射自顯影圖17DNADNA的半保留復制的生物學意義：的半保留復制的生物學意義： DNA DNA在代謝上的穩定性并非指在代謝上的穩定性并非指

12、DNADNA是一種惰性物質。是一種惰性物質。 DNADNA的半保留復制表明了的半保留復制表明了DNADNA在代謝在代謝上的上的穩定性穩定性，是，是保證親代的遺傳信息保證親代的遺傳信息穩定地傳遞給后代必要措施。穩定地傳遞給后代必要措施。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復18二、二、DNADNA復制的起點與方向復制的起點與方向1920雙向復制雙向復制單向復制單向復制21復制中的DNA 復制原點復制原點復制叉復制叉第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復22DNADNA復制的主要方式復制的主要方式 大腸桿菌雙鏈大腸桿菌雙鏈環狀環狀DNADNA的復制（的復制（一個一個復制起點，復制起點，

13、雙向復制）雙向復制）3 不同位置不同位置D-D-環式環式復制方式（線粒體雙鏈環狀復制方式（線粒體雙鏈環狀DNADNA：兩條鏈的兩條鏈的復制起點復制起點不同位置，且復制不同步）不同位置，且復制不同步） 真核細胞真核細胞線狀染色體線狀染色體DNADNA的復制方式（的復制方式（多個多個復制起復制起點，雙向復制）點，雙向復制） 單向單向滾環式滾環式復制（噬菌體復制（噬菌體 X174DNAX174DNA單鏈環狀）單鏈環狀）23DNA的幾種復制方式的幾種復制方式 24親代雙鏈（或單鏈）親代雙鏈（或單鏈）DNADNA的一條鏈在的一條鏈在DNADNA復制復制起點處被切開，其起點處被切開，其55端游離出來。端游

14、離出來。DNADNA聚合酶聚合酶便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3-OH3-OH端。端。當復制向前進行時，親代當復制向前進行時，親代DNADNA上被切斷的上被切斷的55端端繼續游離下來，并且很快被單鏈結合蛋白所繼續游離下來，并且很快被單鏈結合蛋白所結合。因為結合。因為55端從環上向下解鏈的同時伴有端從環上向下解鏈的同時伴有環狀雙鏈環狀雙鏈DNADNA環繞其軸不斷的旋轉，而且以環繞其軸不斷的旋轉，而且以3-OH3-OH端為引物的端為引物的DNADNA生長鏈則不斷地以另一生長鏈則不斷地以另一條環狀條環狀DNADNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環

15、(Rolling circle)復制。復制。 25在這種復制方式中，在這種復制方式中，DNA的延伸可以一直進行下的延伸可以一直進行下去，產生的去，產生的DNA鏈可以是親代鏈可以是親代DNA單位長度的許單位長度的許多倍。這么長的多倍。這么長的DNA鏈是如何轉變為單位長度的鏈是如何轉變為單位長度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特異的內分子的，目前尚不清楚。可能是由特異的內切酶切開產生單位長度的子代切酶切開產生單位長度的子代DNA。這些。這些DNA可可自身環繞，或保持線性分子狀態。自身環繞，或保持線性分子狀態。 26雙鏈環在固定點解開進行復制，但兩條鏈的雙鏈環在固定點解開進行復制，但兩條鏈的合

16、成是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一合成是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到條鏈保持單鏈而被取代，在電鏡下可以看到呈呈D D環形狀。待一條鏈復制到一定程度，露出環形狀。待一條鏈復制到一定程度，露出另一鏈的復制起點，另一條鏈才開始復制。另一鏈的復制起點，另一條鏈才開始復制。這表明復制起點是以一條鏈為摸板起始合成這表明復制起點是以一條鏈為摸板起始合成DNADNA的一段序列；兩條鏈的起點并不總在同一的一段序列；兩條鏈的起點并不總在同一點上，當兩條鏈的起點分開一定距離時就產點上，當兩條鏈的起點分開一定距離時就產生生D D環（環（D-loopD-loop）復制。）復制

17、。F.F.27多復制叉復制多復制叉復制 第一輪復制尚未完成，復制起點就開始第二輪第一輪復制尚未完成，復制起點就開始第二輪的復制。的復制。 28三、三、DNADNA復制的半不連續性復制的半不連續性前導鏈前導鏈滯后鏈滯后鏈岡崎片段岡崎片段前導鏈：前導鏈：以以3 5 方向的親方向的親代鏈為模板連續合成的子代鏈。代鏈為模板連續合成的子代鏈。滯后鏈：滯后鏈：以以5 3方向的親方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復制代鏈為模板的子代鏈先逆復制叉移動方向合成岡崎片段，再叉移動方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。連接成滯后鏈。29半不連續復制的發現半不連續復制的發現 同位素實驗，用含同位素實驗，用含3 3H H的的d

18、TdT標記用標記用T T4 4噬菌體感染的大腸噬菌體感染的大腸桿菌桿菌 短時間內分離的短時間內分離的DNADNA均為均為DNADNA小片段小片段一段時間一段時間后后檢測到檢測到 DNADNA大片段。當用大片段。當用DNADNA連接酶的缺失的變異連接酶的缺失的變異株時，檢測到大量株時，檢測到大量DNADNA片段的積累。片段的積累。證明證明DNADNA復制中有復制中有小片段合成。小片段合成。 測定測定DNADNA小片段，遠遠大于合成小片段，遠遠大于合成DNADNA的一半。似乎兩條的一半。似乎兩條鏈都是不連續合成的，后發現是由于鏈都是不連續合成的，后發現是由于U U替代替代dTdT滲入滲入DNADN

19、A中，中，而被尿嘧啶而被尿嘧啶-N-N-糖基酶切除所致。糖基酶切除所致。 在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶-N-N-糖基酶的突變植株中，糖基酶的突變植株中，DNADNA的的U U不再不再被切除，則被切除，則檢測到一半檢測到一半3 3H H標記出現在小片段（岡崎片段）標記出現在小片段（岡崎片段）中。中。 1968 1968日本學者岡崎：日本學者岡崎：30Arthur Kornberg Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford University Stanford, CA, USAStanford, CA, USA The Nobel Prize

20、 in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid31四、與四、與DNADNA復制有關的酶和蛋白質復制有關的酶和蛋白質n原料：原料：四種脫氧核苷三磷酸四種脫氧核苷三磷酸 （dATPdATP、dGTP dCTP dTTP)dGTP dCTP dTTP)n需要模板：需要模板：以以DNADNA為模板鏈，合成子代為模板鏈，合成子代DNADNA，模板可以，模板可以是雙鏈，也

21、可以是單鏈是雙鏈，也可以是單鏈DNADNA。合成產物與模板互補。合成產物與模板互補。n 需要引物：需要引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）為引物，在大腸桿）為引物，在大腸桿 菌中，菌中，DNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA鏈作為引物，引物含鏈作為引物，引物含3 -OH. 3 -OH. n合成方向：合成方向：5 5 3 3 ( (一一) ) DNADNA聚合酶：聚合酶：19561956年年KornbergKornberg等在大腸桿菌中等在大腸桿菌中首先發現首先發現DNADNA聚合酶，其后發現該酶在許多生物中廣聚合酶，其后發現該酶在許多生物中廣泛存在。泛存在。該酶的

22、催化性質如下：該酶的催化性質如下：第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復32（二）大腸桿菌（二）大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶（1 1）5 5 3 3 聚合酶聚合酶功能（但持續合成功能（但持續合成DNADNA的能力差）；的能力差）； （2 2）3 3 5 5外切酶外切酶活性（對雙鏈無作用，在正常聚合活性（對雙鏈無作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈，只作用于生長中不配條件下，此活性不能作用于生長鏈，只作用于生長中不配對的單鏈，校對功能。）；對的單鏈，校對功能。）；（3 3）還具有）還具有5 5 33外切酶外切酶活性（雙鏈有效）；活性（雙鏈有效）；1 1、DNADNA聚合酶聚合

23、酶:19561956年年KornbergKornberg首先從首先從大腸桿菌大腸桿菌中分中分離。該酶為單體酶離。該酶為單體酶, ,含一個鋅原子。為多功能酶，具有含一個鋅原子。為多功能酶，具有: : 該酶缺失時大腸桿菌仍具有該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNADNA合成酶活性，只是對合成酶活性，只是對DNADNA損傷的修復能力損傷的修復能力下降，容易導致變異和死亡。推測該下降，容易導致變異和死亡。推測該酶主要是對酶主要是對DNADNA損傷的修復，以及在損傷的修復，以及在DNADNA復制時復制時RNARNA引物切引物切除及其缺口的填補。除及其缺口的填補。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復33D

24、NADNA聚合酶催化的反應：聚合酶催化的反應：34DNADNA聚合酶聚合酶的功能的功能351聚合作用在引物RNA3-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專一性主要表現為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結合位點后，可能使酶的構象發生變化，促進3-OH與5-PO4結合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結合位點，則不能與模板配對，無法改變酶的構象而被3-5外切酶活性位點所識別并切除之。 36235外切酶活性校對作用這種酶活性的主要功能是從35方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸

25、。 3738353外切酶活性切除修復作用從53方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用。每次能切除10個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。對岡崎片段5末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性。 394焦磷酸解作用DNApol的這種活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認為是DNA聚合作用的逆反應，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi (dNMP)n-x+X

26、(dNPPP)DNA 5焦磷酸交換作用催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應。反應式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA （4、5兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。 ）402 2、DNADNA聚合酶聚合酶： 多亞基酶，聚合作用，聚合活力比多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNADNA聚聚合酶合酶高；持續合成高；持續合成DNADNA的能力差。該酶缺的能力差。該酶缺失時大腸桿菌仍具有失時大腸桿菌仍具有DNADNA合成能力，推測該合成能力，推測該酶仍然不是真正的酶仍然不是真正的DNADNA聚合酶。該酶聚合酶。該酶具有具有3

27、3 5 5外切酶活性外切酶活性。其功能可能在。其功能可能在修復修復紫外光引起的紫外光引起的DNADNA損傷損傷中起作用。中起作用。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復413 3、DNADNA聚合酶聚合酶 多亞基酶，含多亞基酶，含十種亞基十種亞基: :（），其中（，其中（）稱）稱為為核心酶核心酶，2 2稱為夾子，（稱為夾子，（2 2）組成）組成復合物復合物，其主要功能是幫助，其主要功能是幫助亞基夾住亞基夾住DNADNA，故，故稱為稱為夾子裝配器夾子裝配器，該酶，該酶DNADNA合成的合成的持續能力強持續能力強，主，主要與該結構有關。另外，該酶合成要與該結構有關。另外，該酶合成速度大，活性

28、高，速度大，活性高，缺失時大腸桿菌因缺失時大腸桿菌因DNADNA復制抑制而致死。因此認為復制抑制而致死。因此認為該酶該酶DNADNA的真正復制酶的真正復制酶。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復42DNADNA聚合酶聚合酶全酶的亞基組成全酶的亞基組成亞基亞基 相對分相對分子量子量亞基亞基數目數目基因基因亞基功能亞基功能1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadXholAholBholCholDdnaN聚合作用聚合作用3 5外切酶的校對功能外切酶的校對功能組建核心酶組建核

29、心酶使核心酶二聚化使核心酶二聚化依賴依賴DNADNA的的ATPATP酶，形成酶，形成復合物復合物與與亞基結合，形成亞基結合，形成復合物復合物形成形成復合物復合物形成形成復合物復合物形成形成復合物復合物兩個兩個亞基形成滑動夾子，以提高酶亞基形成滑動夾子，以提高酶的持續合成能力。的持續合成能力。43DNA聚合酶聚合酶的異二聚體的異二聚體前導鏈的合成前導鏈的合成滯后鏈的合成滯后鏈的合成44 DNA DNA聚合酶聚合酶的的- -鉗子鉗子俯視圖俯視圖DNA雙螺旋雙螺旋45DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶結構基因結構基因不同種類的亞基不同種類的亞基數目數目相對分子質量相對分子質量35

30、外切酶外切酶53外切酶外切酶聚合速度（核苷聚合速度（核苷酸酸/分）分）持續合成能力持續合成能力功能功能Pol A1103,0001,000-1,2003-200切除引物，修復Pol B788,0002,4001,500修復Pol C10830,00015,000-60,000500,000復制大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNA聚合酶比較聚合酶比較46( (三）三）DNADNA連接酶：連接連接酶：連接DNADNA雙鏈中的單鏈切口雙鏈中的單鏈切口作用特點：作用特點： 大腸桿菌和其它細菌的大腸桿菌和其它細菌的DNADNA連接酶連接酶要求要求NADNAD+ +提供能量；在高等生物和噬菌體中的提供能量；在高

31、等生物和噬菌體中的DNA連接酶連接酶，則要求，則要求ATPATP提供能量。提供能量。T T4 4噬菌體的噬菌體的DNADNA連接酶不僅能連接雙鏈連接酶不僅能連接雙鏈DNADNA上的粘性切口，而且能連接無粘性末上的粘性切口，而且能連接無粘性末端的平頭雙鏈端的平頭雙鏈DNADNA。 DNA DNA連接酶在連接酶在DNADNA復制、損傷修復、重復制、損傷修復、重組組等過程中起重要作用。等過程中起重要作用。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復47DNADNA連接酶作用機理連接酶作用機理481、拓撲異構酶、拓撲異構酶 拓撲異構酶：拓撲異構酶：催化催化DNADNA的拓撲連環數發的拓撲連環數發生變化

32、的酶，在生變化的酶，在DNADNA重組修復和其它轉變方重組修復和其它轉變方面起重要作用。面起重要作用。 除連環數不同外其它性質均相同的除連環數不同外其它性質均相同的DNADNA分子稱為分子稱為拓撲異構體拓撲異構體，引起拓撲異構體反，引起拓撲異構體反應的酶稱為應的酶稱為拓撲異構酶拓撲異構酶。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復49( (四四) )與與DNADNA合成有關的其它蛋白因子合成有關的其它蛋白因子( (大腸桿菌中大腸桿菌中) )蛋白質蛋白質功能功能相對分子量相對分子量（10103 3）分子分子/ /細胞細胞DNADNA旋轉酶（或拓旋轉酶（或拓撲異構酶）撲異構酶）DNADNA解鏈酶

33、解鏈酶單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白引物合成酶引物合成酶DNADNA聚合酶聚合酶引入或松開引入或松開超螺旋超螺旋使雙鏈使雙鏈DNADNA解鏈解鏈穩定單鏈區穩定單鏈區合成合成RNARNA引物引物除去引物并除去引物并填滿缺口填滿缺口400400656574746060109109505030030010010030030050 拓撲異構酶拓撲異構酶：使使DNADNA一條鏈發生斷裂和再一條鏈發生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應不需要能連接。作用是松解負超螺旋，反應不需要能量。主要集中在活性轉錄區，同轉錄有關。量。主要集中在活性轉錄區，同轉錄有關。 拓撲異構酶拓撲異構酶：使使DNADNA兩條鏈發生斷裂

34、和再兩條鏈發生斷裂和再連接。當引入負超螺旋時需要由連接。當引入負超螺旋時需要由ATPATP提供能量，提供能量，同復制有關。同復制有關。兩類拓撲異構酶作用特點兩類拓撲異構酶作用特點: : 二者共同控制二者共同控制DNADNA的拓撲結構。的拓撲結構。第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復51522 2、解螺旋酶、解螺旋酶 （解鏈酶）（解鏈酶） 通過水解通過水解ATPATP將將DNADNA兩條鏈打開。兩條鏈打開。E.coliE.coli中的中的reprep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I I、IIII、IIIIII。每解開一對堿基需要水解。每解開一對堿基需要水解2

35、 2個個ATPATP分子。分子。 穩定穩定DNADNA解開的單鏈，防止復性和保護單解開的單鏈，防止復性和保護單鏈部分不被核酸酶水解。鏈部分不被核酸酶水解。3 3、單鏈結合蛋白：、單鏈結合蛋白：第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復53解螺旋酶（解螺旋酶（helicasehelicase）可以促使）可以促使DNADNA在復制叉處在復制叉處打開雙鏈。解螺旋酶可以和單鏈打開雙鏈。解螺旋酶可以和單鏈DNADNA結合，并且結合，并且與與ATPATP結合，利用結合，利用ATPATP分解成分解成ADPADP時產生的能量沿時產生的能量沿DNADNA鏈向前運動促使鏈向前運動促使DNADNA雙鏈打開。目前，

36、大腸桿雙鏈打開。目前，大腸桿菌中發現有兩種解螺旋酶參與這個過程，一種稱菌中發現有兩種解螺旋酶參與這個過程，一種稱為解螺旋酶為解螺旋酶I I、IIII、IIIIII，與滯后鏈的模板，與滯后鏈的模板DNADNA結結合沿合沿5353方向運動方向運動; ;第二種稱為第二種稱為RepRep蛋白，和前蛋白，和前導鏈的模板導鏈的模板DNADNA結合沿結合沿3535方向運動。方向運動。 54單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(SSBP) 螺旋酶沿復制叉方向向前推進產生了一段單鏈區，但是這種單鏈螺旋酶沿復制叉方向向前推進產生了一段單鏈區，但是這種單鏈DNADNA不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈不會長久存在，會很

37、快重新配對形成雙鏈DNADNA或被核酸酶降解。在細或被核酸酶降解。在細胞內有大量單鏈胞內有大量單鏈DNADNA結合蛋白能很快地和單鏈結合蛋白能很快地和單鏈DNADNA結合，防止其重新結合，防止其重新配對形成雙鏈配對形成雙鏈DNADNA或被核酸酶降解。一個或被核酸酶降解。一個SSBPSSBP四聚體結合于單鏈四聚體結合于單鏈DNADNA上可以促進其他上可以促進其他SSBPSSBP四聚體現相鄰的單鏈四聚體現相鄰的單鏈DNADNA結合，這個過程稱為協結合，這個過程稱為協同結合同結合(cooperative binding)(cooperative binding)，SSBPSSBP結合到單鏈結合到單鏈

38、DNADNA上后，使其呈上后，使其呈伸展狀態，沒有彎曲和結節，有利于單鏈伸展狀態，沒有彎曲和結節，有利于單鏈DNADNA作為模板。作為模板。SSBPSSBP可以重可以重復使用，當新生的復使用，當新生的DNADNA鏈合成到某一位置時，該處的鏈合成到某一位置時，該處的SSBPSSBP便會脫落，便會脫落，并被重復利用。并被重復利用。 55 引發體可以沿模板鏈引發體可以沿模板鏈5 5 3 3方向移動方向移動, ,具有具有識識別合成起始位點別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引的功能，移動到一定位置上即可引發發RNARNA引物的合成。移動和引發均需要引物的合成。移動和引發均需要ATPATP提供能量

39、，提供能量， nn蛋白具有蛋白具有ATPATP酶的活力。引發體的移動與復制叉酶的活力。引發體的移動與復制叉移動的方向相同，與移動的方向相同，與岡崎片段岡崎片段的合成方向相反。的合成方向相反。3 3、引物合成酶與引發前體、引物合成酶與引發前體 引物合成酶：引物合成酶：催化引物催化引物RNARNA的生成的生成 引發前體引發前體: :它由多種蛋白質它由多種蛋白質dnaAdnaA、dnaBdnaB、dnaCdnaC、n n、nn、nn和和i i組成。引發前體再與引發酶結組成。引發前體再與引發酶結合組裝成引發體。合組裝成引發體。 第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復56（五）、參（五）、參與與D

40、NA復制復制的酶與蛋白的酶與蛋白因子總覽圖因子總覽圖57五、五、 DNADNA的復制過程的復制過程：（以大腸桿菌為例）（以大腸桿菌為例） 復制的終止復制的終止： 復制的起始復制的起始1 1、起始復合物的形成：稱為引發、起始復合物的形成：稱為引發2 2、RNARNA引物的合成引物的合成 鏈的延伸：鏈的延伸：第第34章章 DNA的復制和修復的復制和修復58復制原點復制原點oriC和原點的識別：和原點的識別： 從復制原點到終點，組成一個從復制原點到終點，組成一個復制單位復制單位，叫，叫復制子復制子（基因組獨立進行復制的單位）。（基因組獨立進行復制的單位）。 DNA DNA的復制有特定的起始位點，叫做

41、的復制有特定的起始位點，叫做復制原點復制原點。常用。常用ori C(ori C(或或o o）表示。大腸桿菌的復制原點）表示。大腸桿菌的復制原點ori Cori C由由245245個個bpbp構成，含兩組保守的重復序列：三個構成，含兩組保守的重復序列：三個13bp13bp的序列（富含的序列（富含A A、T T的序列）和四個的序列）和四個9bp9bp的序列；許多生物的復制原點也都是的序列；許多生物的復制原點也都是富含富含A A、T T的區段的區段。復制原點復制原點由由DnaADnaA蛋白識別，蛋白識別， 在原點由在原點由DnaBDnaB蛋白（解螺旋蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態，分別作為模

42、板，合成其互酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態，分別作為模板，合成其互補鏈補鏈(DNA(DNA雙鏈的解開還需雙鏈的解開還需DNADNA拓撲異構酶拓撲異構酶 、 SSB),SSB),在原在原點處形成一個眼狀結構，叫點處形成一個眼狀結構，叫復制眼復制眼。59（一）復制起始（一）復制起始1 1、拓撲異構酶解開超螺旋。、拓撲異構酶解開超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白識別并在蛋白識別并在ATPATP存在存在下結合于四個下結合于四個9bp9bp的重復序列。的重復序列。3 3、在類組蛋白（、在類組蛋白（HUHU、ATPATP參與下參與下, , Dan ADan A蛋白變性蛋白變性1313個個bpbp的重復序

43、的重復序列列, ,形成開鏈復合物。形成開鏈復合物。4 4 、Dna BDna B借助于水解借助于水解ATPATP產生的產生的能量在能量在Dna CDna C的幫助下沿的幫助下沿5 3 5 3 方向移動，解開方向移動，解開DNADNA雙鏈，形成雙鏈，形成前引發復合物。前引發復合物。5 5、單鏈結合蛋白結合于單鏈。、單鏈結合蛋白結合于單鏈。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）開蛋白）開始合成始合成RNARNA引物。引物。6061(二二) 鏈的延鏈的延長（岡崎片長（岡崎片段的合成）段的合成） 真核生物的真核生物的岡崎片段為：岡崎片段為：100-200bp100-200bp 原

44、核生物的原核生物的岡崎片段為：岡崎片段為：1000-2000bp1000-2000bp62 DNA DNA鏈的延伸鏈的延伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以四種以四種5 -5 -脫氧核苷三磷脫氧核苷三磷酸為底物，在酸為底物，在RNARNA引物的引物的33端以磷酸二酯鍵連接上脫端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。磷酸。DNADNA鏈的延伸同時進鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。兩條鏈方向相反。 前導鏈前導鏈 滯后鏈滯后鏈 岡崎片段岡崎片段 半不連續復制半不連續復制岡崎模型岡崎模型6364岡崎片段引物

45、的切除、缺口的填補和切口的連接岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:65 前導鏈和滯后鏈的合成（前導鏈和滯后鏈的合成（DNADNA聚合酶的異二聚體催化）聚合酶的異二聚體催化）6667(三三) 復制的終止復制的終止順時針終止陷阱順時針終止陷阱逆時針終止陷阱逆時針終止陷阱 Ter: Ter:終止陷阱，引起復制終止的特定區域，終止陷阱，引起復制終止的特定區域，20bp20bp的序列，終止的序列，終止利用物質利用物質TusTus可識別并結合，從而導致可識別并結合，從而導致DNADNA復制的終止。復制的終止。68大腸桿菌大腸桿菌DNADNA復制的終止復制的終止69( (四四) DNA) DNA復制

46、的精確性（高保真復制）復制的精確性（高保真復制）1 1、堿基的配對規律：、堿基的配對規律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為對保證堿基配錯幾率約為1/101/104 41/101/105 5。2 2、DNADNA聚合酶的聚合酶的3535外切酶活性的校對功能，外切酶活性的校對功能，使使堿基的錯配幾率又降低堿基的錯配幾率又降低10010010001000倍。倍。3 3、DNADNA的損傷修復系統。的損傷修復系統。 DNA DNA復制必須具有復制必須具有高度精確性高度精確性，在大腸桿菌的細胞，在大腸桿菌的細胞DNADNA復制中其復制中其錯誤率約為錯誤率約為1/

47、101/109 91/101/101010，即每即每10109 910101010個核苷酸才出現一個錯誤，也就是大腸桿菌染色個核苷酸才出現一個錯誤，也就是大腸桿菌染色體體DNADNA復制復制100010001000010000次才出現一個核苷酸的錯誤。次才出現一個核苷酸的錯誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關：這么高的精確性的保證主要與下列因素有關：70 六、復制起始六、復制起始的時序控制的時序控制71七、真核生物七、真核生物DNADNA復制復制的特點的特點4 4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核生物染色體開

48、始復制；而在快速生長的原核生物染色體DNADNA復制復制中，起點可以連續發動復制。真核生物快速生長時，中，起點可以連續發動復制。真核生物快速生長時，往往采用往往采用更多的復制起點更多的復制起點。1 1、真核生物染色體有多個復制起點，稱為真核生物染色體有多個復制起點，稱為自主復自主復制序列（制序列（ARSARS）或復制基因）或復制基因(replicator);(replicator);多復制眼，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。呈雙向復制，多復制子。2 2、岡崎片段長約岡崎片段長約200bp200bp( (原核原核1000-2000bp)1000-2000bp)。3 3、真核生物真核生物DNADN

49、A復制速度復制速度比原核比原核慢慢，速度為，速度為100010003000bp/min(3000bp/min(僅為原核生物的僅為原核生物的1/201/201/501/50）。）。72真核真核DNADNA復制特點復制特點7 7、RPARPA：真核生物的單鏈結合蛋白；真核生物的單鏈結合蛋白；RNaseHRNaseH1 1和和MF-1MF-1切除切除RNARNA引物，引物，DNADNA聚合酶聚合酶填補缺口。填補缺口。5 5、真核生物有真核生物有多種多種DNADNA聚合酶聚合酶,DNA,DNA聚合酶聚合酶（）是真正的復制酶，在是真正的復制酶，在PCNAPCNA存在下有持續的合成能力存在下有持續的合成能

50、力（PCNAPCNA稱為稱為增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原，相當于大腸桿菌，相當于大腸桿菌DNADNA聚聚合酶合酶的的-夾子）。夾子）。RFCRFC蛋白相當于夾子裝配器。蛋白相當于夾子裝配器。6 6、真核生物線性染色體兩端有真核生物線性染色體兩端有端粒結構端粒結構，它是由許，它是由許多成串的重短復序列組成，端粒功能是穩定染色體末多成串的重短復序列組成，端粒功能是穩定染色體末段結構，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈段結構，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5-5-末段在消除末段在消除RNARNA引物后造成的空缺，使染色體引物后造成的空缺，使染色體保保持持一定長度一定長度。端粒酶端粒酶是含

51、一段是含一段RNARNA的逆轉錄酶的逆轉錄酶. .73端粒酶（端粒酶（telomerase） DNA復制需要引物，但在線形復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發現才得到了澄清，端粒酶是短。這一難題是通過端粒酶的發現才得到了澄清，端粒酶是一種含一種含RNA的蛋白復合物，實質上是一種逆轉錄酶，它能的蛋白復合物，實質上是一種逆轉錄酶，它能催化互

52、補于催化互補于RNA模板的模板的DNA片段的合成，使復制以后的線片段的合成，使復制以后的線形形DNA分子的末端保持不變。分子的末端保持不變。 初步研究表明，人體中生殖細胞的端初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識會有助于對生命衰老的認識。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶74端粒合成的

53、一種模型端粒合成的一種模型3 5 TTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和雜交雜交移位和移位和再雜交再雜交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGG

54、GT5 3 TTAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n進一步加工進一步加工繼續繼續延伸延伸動畫動畫7576真核細胞內有五種真核細胞內有五種DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶 DNADNA聚聚合酶合酶 DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶定位定位亞基數目亞基數目外切酶活性外切酶活性引物合成酶活引物合成酶活性性持續合成能力持續合成能力抑制劑抑制劑功能功能細胞核細胞核4 4中等中等蚜腸霉素蚜腸霉素引物合成引物合成細胞核細胞核1 1低低雙脫氧雙脫氧TTPTTP修復修復線粒體線粒體2 23 3 55外切酶外切酶高高雙脫氧雙脫氧TTPT

55、TP線粒體線粒體DNADNA合成合成細胞核細胞核2 2 3 5外切酶外切酶有有PCNAPCNA時時高高蚜腸霉素蚜腸霉素核核DNADNA合成合成細胞核細胞核1 15 3 外切酶外切酶高高蚜腸霉素蚜腸霉素修復修復77真核細胞真核細胞DNADNA復制示意圖復制示意圖78八、八、DNADNA損傷的修復損傷的修復 DNA DNA突變：突變： DNADNA的的核苷酸順序核苷酸順序永久性的改變稱為永久性的改變稱為DNADNA的的突變。其主要形式有：突變。其主要形式有： 1.1.點突變：點突變：DNADNA分子中一個堿基對替代另一個堿基對分子中一個堿基對替代另一個堿基對稱為點的突變。稱為點的突變。 2.2.插

56、入作用：插入作用：DNADNA分子中插入一個或幾個堿基稱為插分子中插入一個或幾個堿基稱為插入作用。入作用。 3.3.缺失作用：缺失作用： DNADNA分子中缺失一個或多個堿基對稱為分子中缺失一個或多個堿基對稱為缺失作用。缺失作用。 DNA DNA在復制時產生錯配，病毒基因整合，某些物化因在復制時產生錯配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，都可能使子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，都可能使DNADNA的的結構及功能發生改變結構及功能發生改變。從而引起生物突變，甚至導致。從而引起生物突變，甚至導致死亡。死亡。 DNA DNA的損傷與的損傷與DNADNA突變：突變：79DNA

57、DNA突變可能導致腫瘤的發生突變可能導致腫瘤的發生: 著色性干皮病：著色性干皮病：對嘧啶二聚體和大的對嘧啶二聚體和大的DNADNA損傷修損傷修復酶的缺失而產生的一種皮膚癌。復酶的缺失而產生的一種皮膚癌。 沉默突變：沉默突變：突變影響非必需的突變影響非必需的DNADNA或突變對一個或突變對一個基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變。基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變。 回復突變：回復突變：一些突變可以克服第一次突變造成的一些突變可以克服第一次突變造成的影響，這類突變稱為回復突變。影響，這類突變稱為回復突變。 動物動物細胞的突變細胞的突變與癌的發生有強烈的相關性。與癌的發生有強烈的相關性。通常生物

58、體通常生物體DNADNA的損傷有一系列的的損傷有一系列的修復機制修復機制，如：，如：錯配修復、堿基的切除修復、核苷酸的切割修復、錯配修復、堿基的切除修復、核苷酸的切割修復、直接修復、重組修復等。直接修復、重組修復等。80DNADNA損傷的修復機制損傷的修復機制: :1 1、參與錯配修復的酶與蛋白質、參與錯配修復的酶與蛋白質DamDam甲基化酶甲基化酶 ; MutH; MutH、MutLMutL、MutSMutS蛋白蛋白 ; ; 解螺旋酶解螺旋酶 ; DNA ; DNA聚合酶聚合酶 ; ;外切酶外切酶、 、 ； RecJRecJ核酸酶核酸酶DNADNA連接酶連接酶 ； SSBSSB（一）錯配修復（一）錯配修復81MutS識別并結合于堿基錯配處識別并結合于堿基錯配處MutH-MutLMutH-MutL二聚體結合后沿兩個方向二聚體結合后沿兩個方向移動，形成移動，形成DNADNA環，直至遭遇半甲基環，直至遭遇半甲基化的化的CTAGCTAG。MutH在在CTAG的的5-端切開一個切口，核端切開一個切口，核酸外切酶酸外切酶、沿沿3 5方向切除含配錯方向切除含配錯堿基的新鏈堿基的新鏈DNADNA聚合酶聚合酶補缺，補缺，DNADNA連接酶連接切口連接酶連接切口。高高度度耗耗能能的的錯