1、1、質粒提取不成功的原因(1) 裂解時間太長。加入溶液 P2后裂解時間不應超過 5分鐘。(2) 吸附時間不夠(3) 溶解時間不夠(4) 大腸桿菌老化。建議涂布平板培養后。重新挑選新菌落進行液體培養。(5) 質粒拷貝數低。由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具體相同 功能的高拷貝數載體。(6) 菌體中無質粒。有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成 質粒丟失。例如。柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。 另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。堿裂解不充分。使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶

2、液 P1、P2和P3的用量。對低拷貝數質粒。提取時，可加倍使用溶液 P1、P2和P3，可能有助于增加質粒提取量和質料質量。(7) 溶液使用不當。溶液 P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置于37C保溫片刻直至 溶解為清亮的溶液，才能使用。(8) 吸附柱過載。不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如 TB或者X YT菌液體積必須減少； 若質粒或宿主菌是非常高 的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液體積。(9) 質粒未全部溶解。洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。(10) 乙醇殘留。漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應晾干

3、樹 脂，再加入洗脫緩沖液。(11) 洗脫液加入位置不正確。洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅 膠膜的表面達到最大洗脫效率。(12) 洗脫液不合適。DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB( 10 mM Tris?CI,pH8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在 pH7.08.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果 pH過低可能性導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至60 C后使用有利于提高洗脫效率。(13) 洗脫體積太小。洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高， 但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。(

4、14) 混有蛋白。不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理并離心后溶液應為澄清的， 如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進行下一步驟。DNA電泳中常出現的問題1、提大腸桿菌質粒后跑瓊脂糖凝膠電泳無條帶出現在確定瓊脂糖凝膠電泳無問題的前提下，那應該就是質粒提取有問題。首先觀質粒是高拷貝還是低拷貝的質粒。一般低拷貝的質粒 5ml的。高拷貝的質粒 2-3ml小劑量提取。量不能過大，否則影響提取。第二點，加入裂解液如 SDS-NaOH后，時間不宜超過 5min，因為此步驟的目的是使細胞內物質釋放，蛋白質，染色 體DNA和質粒DNA變性，時間過長，會導致加入中和裂解液如酸性醋酸鉀后，仍無法使質

5、 粒DNA復性。導致提取失敗。2、電泳無條帶的原因(1) 上樣量太小。解決方案是增加上樣量。(2) 樣品分子量不在膠允許范圍內。建議另外配置合適的膠。(3) 提取不干凈或緩沖液有問題。(4) 菌的問題，菌種是否正確。有沒有確信加了抗生素，質粒拷貝數高不高，菌量夠不夠然后提取的時候，試劑盒牌子質量過不過硬，有沒有過期，裂解是不是完全，會不會SDS或者高鹽都結晶沉淀了。所有溶液有沒有加錯，比如說柱分離，漂洗液里面有沒有確信加了酒精，洗脫時候洗脫液假如用的是純水，有沒有調過pH值，加的量夠不夠。有沒有完全浸潤硅膠膜。(5) 最后跑電泳的時候，有沒有確信加了EB。加的樣品量有多少，有沒有增加樣品量看觀

6、。3、marker條帶非常模糊，無法辨別具體條帶的原因(1) marker條帶出現了降解。請確保在使用過程中避免核酸酶污染；(2) 電泳緩沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，ph值上升。緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經常更換電泳緩沖液；(3 )電泳條件不合適。電泳時電壓應不超過20v/cm。溫度應低于30 C；(4) marker上樣量過多。請根據說明書選用合適上樣量；(5) 凝膠質量不好。建議使用質量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導致條帶模 糊。DNA回收中常出現的問題1、沒有回收到 DNA片段如在洗脫后，發現洗脫液中沒有 DNA片段，請檢查是否按瓶身標簽，在洗滌液中

7、加 入了無水乙醇2、提取率低(1) 融膠液為酸性緩沖液，如融膠后，其pH值升高將影響提取得率請加滲透0.1倍體積 的3M乙酸鉀(pH5.0).(2) 長時間使用后沒有更換的電泳緩沖液，其pH值較高，將影響DNA的吸附請更換新 的電泳緩沖液后，再入行電泳，然后切膠(3) 在洗脫前，將洗脫液于 3060 C溫浴，可提高提取效率3、來回收得片段為什么電泳上樣會漂起來？ 主要問題是純化過程中的乙醇沒有除干凈。4、膠很難融如何處理？將融膠問題提高到 60度；可能是膠的濃度太高，需要提高融膠液的體積；融膠過程中每隔 一段時間就震蕩幾下幫助融膠。5、如果膠在后續過程發生膠沒有徹底融化，如何補救？補加融膠液，

8、將膠懸起來。50-60度繼續保溫至徹底融化。6、如果DNA純化的得率非常低或根本沒有。估計是什么問題？一點都不能得到產物的回收情況很少見，有些情況是判定回收效率的方式不對。 如對，請檢查一下 Wash中有沒有加入酒精；檢查加入的 DNA結合劑(Solution S或Solution SN)的量 對不對；洗脫前有沒有將殘留得酒精去徹底；洗脫液有沒有使吸附材料充分接觸(洗脫)，接觸的時間是否充分。7、用Ez-Resin如果涼干過頭，如何處理？答：力口 TE，50-60度處理10分鐘，間或振蕩，離心收集上清。外源質粒對大腸桿菌的轉化中常出現的問題1、大腸桿菌經質粒轉化后鋪板生長菌落大小不一轉入空載質粒、含有