1、最新資料推薦表面活性劑在生物學或生物化學實驗室使用的去污劑都是作用比較溫和的表面活性劑（=表面活性成分），是用來破壞細胞膜（裂解細胞）以釋放細胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)。 它 們可以破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)、脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，使蛋白質(zhì)發(fā) 生結(jié)構(gòu)上的變性，防止蛋白質(zhì)結(jié)晶，另外在免疫學實驗中還可避免非特異性吸附。去污劑根據(jù)其特性可以分為好幾類，因此科學研究中去污劑的選擇很關(guān)鍵， 取決 于后續(xù)研究的具體內(nèi)容。實際應(yīng)用中有眾多不同的去污劑可以選擇。 為了某些特殊的應(yīng)用，新的去污劑被 不斷開發(fā)出來。在這篇綜述中，對一些最常用的去污劑的特點和應(yīng)用進行了論述。去污劑是由一個疏水尾端基團和一個極性親水頭端基

2、團組成的有機化合物（圖一A）。在一定的溫度條件下，以特定濃度溶解于水時，去污劑分子會形成膠束， 疏水基團部分位于膠束內(nèi)部，而極性親水基團則在其外部（圖一B）。因此，膠束的疏水中心會結(jié)合到蛋白的疏水區(qū)域。 一個膠束中，去污劑分子的聚集數(shù)目， 是用來評價膜蛋白溶解度的一個重要參數(shù)。 去污劑分子疏水區(qū)域的長度和其疏水 性成正比，且去污劑的疏水區(qū)域非常恒定，而極性頭端親水基團是可變的，可據(jù) 其特點，把去污劑分為三類：離子型（陰離子或陽離子型），兩性離子型和非離 子型（見表一）。在特定的溫度下，表面活性劑分子締合形成膠束的最低濃度， 稱之為臨界膠束濃度（CMC。當去污劑低于臨界膠束濃度時，只有單體存在；

3、 當高于臨界膠束濃度時，膠束、單體以及其余不溶于水的非膠束相共存。同樣， 膠束形成的最低溫度稱為臨界膠束溫度（CMT。因此，溫度和濃度是去污劑兩 相分離和溶解性的重要參數(shù)。一般來說，低親脂或憎油的去污劑的臨界膠束濃度 會較高。表一：去污劑的分類。種類化合物離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS，脫氧膽酸鈉， 膽酸鈉，肌氨酸非離子去污劑trit on X-100 ，十二烷基麥芽糖苷，洋地黃皂苷，twee n 20，tween 80兩性離子去污劑CHAPS離液劑尿素圖1.去污劑單體的一般結(jié)構(gòu)Tail of zwitterionicdeleentsHydrophilic 左/ h電adgroupHydro

4、phobic Protein detergent comjIqk離子去污劑離子去污劑是由一個親水鏈和一個陽離子或陰離子的極性頭端基團組成。此類去污劑的臨界膠束濃度一般高于非離子去污劑。此類去污劑活性較強。十二烷基硫酸鈉（SDS陰離子去污劑：SDS是一種非常高效的表面活性劑，幾 乎可以使所有的蛋白質(zhì)溶解。它可以破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵，從而使蛋白質(zhì)變性， 并喪失天然構(gòu)象和功能。SDS以質(zhì)量比1.4:1與蛋白質(zhì)結(jié)合（或一個SDS陰離子 結(jié)合二個氨基酸分子），因此即使蛋白質(zhì)樣品處于等電點，SDS也能掩飾蛋白質(zhì)此帶電情況，使其帶負電。這是被廣泛使用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理所 在。通常，為了在SDS存

5、在時完全裂解細胞，樣品必須經(jīng)過超聲處理或若干次通 過19G的針頭，從而確保DNA的完全降解。SDS會使蛋白質(zhì)變性并破壞其三維結(jié) 構(gòu)，因此當研究中需要蛋白質(zhì)的活性或蛋白質(zhì)的相互作用存在時，不能使用SDS 當使用離子去污劑時，此外還要注意一些事項，因為在不同離子強度的緩沖液中， 它們的特性會隨之改變（比如說，當氯化鈉濃度從0增加到500mM寸，去污劑的 臨界膠束濃度會從8mM降至0.5mM另外，SDS在溫度較低時會發(fā)生沉淀，這是 因為它屬于去污劑中臨界膠束溫度最高的一種， 而且這種沉淀現(xiàn)象在鉀鹽存在的 情況下會更加明顯。SDS的這種特性可以用來去除蛋白質(zhì)樣品中的 SDS脫氧膽 酸鈉和膽酸鈉即使沒有

6、一個極性頭端基團， 但是也歸入離子去污劑的類別，是因 為它們的極性基團分布在分子鏈的各個部分。 它們可以用來溶解細胞膜。由于離子去污劑存在極性頭部基團，因此不能通過離子交換色譜法去除它。非離子去污劑非離子型去污劑的頭端基團是沒有極性的親水基團。它們被認為是比較溫和的表 面活性劑，它們可以破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)以及脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，但是不能破壞 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的連接，而且大多非離子去污劑不能使蛋白質(zhì)變性。 因此，這種 去污劑可以使蛋白質(zhì)溶解和分離，但卻保留了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、功能以及它們 的相互作用。在分離膜蛋白的應(yīng)用中，這是此類去污劑的優(yōu)勢所在。圖2.一些常用去污劑的結(jié)構(gòu)和原理Hydrophil

7、i coSDSClTrrton X-1UDC .t )I.n-dodecyl-p-D-maltosideC.ll ilsOllHydrophobic tail headgroupTrit on家族Triton X-100 是一個非離子表面活性劑的重要代表，并應(yīng)用于大多免疫沉淀實 驗中。這個家族的所有成員（Triton X100, Triton X114, No nidet P40, IgepalCA-630）非常相似，僅僅在每個膠束（分別為9.6, 8.0, 9.0 and 9.5）的平均單體數(shù)量和基于PEG（聚乙二醇）的頭端基團的大小分布上有區(qū)別。Triton X100 來源于聚氧乙烯，并含

8、有一個苯基疏水基團。Triton X100 臨界膠束濃度較低，因此不易通過透析法去除。其濁點是 64攝氏度，在此溫度下，可以觀察到兩相 分離。十二烷基麥芽糖苷（DDM十二烷基麥芽糖苷（DDM是一種糖苷表面活性劑，越來越多地被用來分離需要 保留活性的疏水性膜蛋白。已證明在此應(yīng)用中，DDMt匕CHAP或NP-40要高效地 多。DDMH鏈的親脂位點、0.17mM的高臨界膠束濃度以及在膠束界面形成的水樣 的微環(huán)境，這對于溶解和保持細胞膜疏水蛋白的穩(wěn)定性非常關(guān)鍵。洋地黃皂苷洋地黃皂苷從紫色毛地黃（洋地黃紫癜）中提取，可以用于分離真核細胞膜疏水 蛋白。肌氨酸和Trit on X-100可以溶解細菌內(nèi)部蛋白

9、，但不是外部的細菌胞膜。Twee n家族Tween-20和Tween-80是具有脂肪酸的酯基團和長聚氧乙烯鏈的聚山梨酯表面活 性劑。它們臨界膠束濃度很低，一般都是溫和的表面活性劑，不僅不影響蛋白質(zhì) 活性，而且溶解蛋白的能力也高。它們不是細胞裂解液的常見組分， 但是通常見 于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗中的洗滌緩沖液，因為它們可以最大程度地減少非特異性結(jié)合的抗體以及去除不結(jié)合的部分。大多數(shù)離子去污劑會干擾紫外線（UV）分光光度法，特別是 Triton X100，因為 此類去污劑都含有一個可以吸收紫外線的苯環(huán)。因此， 280nm紫外線波長下檢測 蛋白質(zhì)吸光度會變的不準確。兩性離子去污劑兩性離子去污劑

10、頭端基團是親水性，含有正負電荷各一個，因此呈現(xiàn)電中性。它 們一般是比非離子型更強烈的表面活性劑。 最典型的例子是3-1-烷磺酸，它比 CHAPS!常見。它的臨界膠束濃度（室溫下 6mM高，可以通過透析的方法高效 去除。在2-4%濃度的等電聚焦和二維電泳的樣品制備中，經(jīng)常使用。 CHAPS和 CHAP不同，CHAPS含有一個極性更強的頭端基團， 可以使它的可溶性更高。因 此，CHAPS可以用于完整細胞膜蛋白的溶解。離液劑各類離液劑是同類物質(zhì)的表面活性劑，它們 可以打破非共價的相互作用（氫鍵， 偶極-偶極相互作用，疏水相互作用），使蛋白質(zhì)發(fā)生可逆性變性。單獨使用尿素，或與硫脲或其它去污劑聯(lián)合使用，

11、在二維電泳或在蛋白組學研究中配制蛋白 質(zhì)的酶消化液中廣泛使用。此外， 在使用尿素的時候需注意不能加熱樣品至 37 攝氏度以上，這會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨甲酰化。用于分離膜蛋白的去污劑很多人對膜蛋白的分離比較感興趣， 但是分離膜蛋白和分離胞質(zhì)蛋白、胞核蛋白 不同，會出現(xiàn)一些特殊的問題。主要原因有膜蛋白表達水平低且很難溶于水溶液， 細胞膜具有比較復(fù)雜的脂質(zhì)層及親水、 疏水區(qū)域。為了提高膜蛋白的溶解性，首 先應(yīng)該選擇臨界膠束濃度較高的去污劑， 另外緩沖液的體積也要足夠大，這樣才 可以加足夠多的去污劑去溶解樣品中所有的膜蛋白。根據(jù)此鏈接，每一個膜蛋白分子至少需要一個膠束，這樣才足以模擬細胞膜的脂質(zhì)環(huán)境（圖 1

12、C-1D）。原則 上,通過調(diào)整溫度和緩沖液中的鹽濃度， 以及利用去污劑的兩相分離的特性， 可 以使膜蛋白有效地溶解。此時，被膠束包繞的膜蛋白和去污劑一起發(fā)生沉淀， 可 溶性蛋白保留在上清中。去污劑緩沖液出現(xiàn)兩相分離的溫度， 稱之為濁點。除了 溫度的影響，濁點還受緩沖液中其它一些因素的影響，比如甘油和鹽類（例如， Triton X114的濁點是23攝氏度，但是如果在去污劑緩沖液中添加了 20%勺甘油， 濁點會降到4攝氏度）。當某個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受高溫影響時， 這就顯得非常重 要。去污劑的選擇良好的去污劑首先應(yīng)該能夠充分裂解細胞， 溶解其中的蛋白，并對后續(xù)的實驗研 究沒有影響。對于想要得到保留天然

13、構(gòu)想的還是變性的蛋白質(zhì)， 這才是第二考慮 的問題。沒有一種去污劑可以適用于所有的實驗研究， 即使應(yīng)用于同一種實驗技 術(shù)，去污劑效果的好壞還取決于實驗所分離的蛋白質(zhì)（表格 1）。因此，通過嘗 試和失敗經(jīng)驗，可以幫助我們找到最合適的去污劑， 此外，還可以嘗試使用去污 劑的混合物。需要再強調(diào)的是，配置新鮮的去污劑緩沖液也很重要， 可以防止久 置的去污劑緩沖液發(fā)生水解和氧化。去污劑的去除殘留去污劑的類型及濃度多少會對實驗有一定影響，因此通常需要降低或者清除 殘留的去污劑。為了實現(xiàn)此目標，可以使用尺寸排阻層析法或者透析法，但這基于膠束大小要不同于所分離的蛋白質(zhì)分子大小，或者膠束要小（例如比較高的臨界膠束

14、濃度）到可以通過透析管。此外，還可使用非極性微球或樹脂結(jié)合去污劑、 環(huán)糊精包合物，使用離子交換色譜法或蛋白質(zhì)沉淀法。但是，在去除去污劑后， 要格外注意防止蛋白質(zhì)的沉淀和聚集。Triton X-100Thermo Fisher Pierce 公司的Trit on X-100 常用來裂解細胞或組織樣品以用于免疫印跡實驗和免疫細胞化學。來自 Amresco公司的30%TritonX-100可以用于 大鼠脊髓組織的勻漿。JT Baker公司的Triton X-100可用于細胞的固定和破膜， 從而使肌動蛋白骨架可見。Packard的Triton-X 用來溶解免疫組織化學技術(shù)中 的一抗。Sigma的Tri

15、ton X-100，用于免疫組織化學技術(shù)中細胞的破膜、圭寸閉液 的配制，用于免疫印跡實驗中細胞或組織樣品的裂解和蛋白質(zhì)的溶解，還可應(yīng)用于PCR實驗、脂質(zhì)體融合實驗、染色實驗。Twee n-20在各種免疫學實驗中，Tween-20經(jīng)常用于洗滌緩沖液中，例如 TBS-T，PBS-TFisher公司的0.05% Tween可用于酶聯(lián)免疫吸附實驗。Amersham Pharmacia的 Tween 20可用于免疫印跡實驗。來源于 Bio-Rad的Tween 20可用來配制PBS-T 緩沖液，用于免疫印跡實驗或用于免疫組織化學實驗中洗滌組織切片。Sigma公司的Tween-20可以用于免疫印跡、酶聯(lián)免疫

16、吸附、免疫共沉淀、原位雜交、多 重PCR或其它實驗技術(shù)。SDSAmresco公司的SDS可用于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。Bio-Rad的十二烷基硫酸 鈉的可用來制備放射免疫沉淀實驗中的分析緩沖液。Q.BIOgene的SDS可用于免 疫印跡實驗中的緩沖液配制。SIGMA勺SDS可用于制備體外辛酰化、Laemmli樣 品及2D-DIGE實驗的緩沖液。NP-40Roche公司的NP-40可用于裂解細胞。Sigma的NP-40可用于制備放射免疫沉淀 實驗中的緩沖液、細胞裂解液、以及免疫共沉淀實驗中的RIPA緩沖液。CHAPS來自Calbiochem的CHAP（2%質(zhì)量體積比）可以用于鑒定卵巢癌的循環(huán)蛋

17、白標 記物的實驗中。Sigma公司的CHAP舸用于制備純化小鼠重組蛋白 proghrelin 的緩沖液、免疫共沉淀的緩沖液、裂解組織的緩沖液。JT Baker的CHAP舸用余裂解細胞以研究人ASF1蛋白分子與病毒的相互作用。洋地黃皂苷MERC公司的洋地黃皂苷可以用于免疫細胞化學實驗中，以研究質(zhì)膜中PI4P的作用。Sigma的洋地黃皂苷可用于細胞破膜，以研究上皮細胞和間充質(zhì)細胞對大 腸桿菌Shiga毒素1的反應(yīng)，還可用于制備提取液，以研究TNF-alpha對巨噬細 胞的作用。其它純化蛋白時，Anatrace 的 n-decyl-beta-D-maltopyranoside 可以用 5mM勺濃度， n-辛基-beta-D-吡喃葡萄糖苷和 Affymetrix 辛基糖新戊二醇（OGNF）可以用 1%的濃度；Sigma的膽甾醇半琥珀酸酯可用0.1% （質(zhì)量體積比）的濃度。表二.常用去污劑的特性和主要應(yīng)用。注：WB,免疫印跡;IP,免疫沉淀；IEF,等電子聚焦；去污劑單體 分子 量Da膠束分子量Da臨界膠束濃度（mM）25 C聚集數(shù)平均膠束質(zhì)量強度透析（去除）應(yīng)用十二烷基硫酸鈉（SDS）28918,0007-106210018,000