1、鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽的含量1 亞硝酸鹽的測定 ( 鹽酸萘乙二胺法 )1.1 原理 樣品經沉淀蛋白質、除去脂肪后，在弱酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸(H2NC6H-SQH)重氮化，產生重氮鹽，此重氮鹽再與偶合試劑(鹽酸萘乙二胺)偶合形成紫 紅色染料，其最大吸收波長為 550nm 測定其吸光度后，可與標準比較定量。1.2 儀器和試劑1小型粉碎機。2分光光度計。325ml 具塞比色管。1氯化銨緩沖溶液： 在 1 000ml 容量瓶中加人 500ml 水， 然后準確加入 20.0ml 鹽酸，振蕩混勻后，再準確加入 50ml 氫氧化銨，用水稀釋至刻度。必要時用稀鹽酸和 稀氫氧化銨調試 pH 至

2、 9.69.7。2硫酸鋅溶液(0.42mol/L):稱取 120g 硫酸鋅(ZnSQ 7HO)，用水溶解，并稀 釋至 1000ml。3氫氧化鈉溶液 (20g/L) ：稱取 20g 氫氧化鈉用水溶解，稀釋至 1 000ml 。4對氨基苯磺酸溶液：稱取 10g 對氨基苯磺酸，溶于 700ml 水和 300ml 冰乙酸 中，置棕色瓶中混勻，室溫保存。5鹽酸萘乙二胺溶液(1g/L):稱職 0.1g 鹽酸萘乙二胺，加 60 聽酸溶解并稀釋 至100ml，混勻后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，1 周內穩定。6顯色劑：臨用前，將鹽酸萘乙二胺溶液(1g/L)和對氨基苯磺酸溶液等體積混合。 僅供 1 次使用。7亞硝

3、酸鈉標準儲備液：準確稱取 250.0mg 于硅膠干燥器中干燥 24h 的亞硝酸 鈉，用水溶解后移入 500ml 容量瓶中， 加 100ml 氯化銨緩沖溶液， 用水稀釋至刻度，混勻， 在 4 C避光保存。此溶液每毫升相當于 500 卩 g 的亞硝酸鈉。8亞硝酸鈉標準使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標準儲備液 1.00ml，置于 100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于5.0 卩 g 的亞硝酸鈉。1.3 操作步驟稱取約 10.00g （糧食稱取 5.00g） 經絞碎混勻的樣品， 置于 250ml 燒杯中， 力卩。 70ml 水和 12ml 氫氧化鈉溶液（20g/L）,混勻，用氫氧化

4、鈉溶液（20g/L）調樣品 pH 至 8,定量 轉移至 200ml 容量瓶中，加 l0ml 硫酸鋅溶液，混勻。如不產生白色沉淀，可再補加 2 5ml 氫氧化鈉溶液，攪拌混勻。置 60C水浴中加熱 10min,取出后冷至室溫，加水至刻 度，混勻。放置 0.5h，用濾紙過濾，棄去初濾液 20ml，收集濾液備用。吸取 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 亞硝酸鈉標準使用液 （相當于 0.0、 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 卩 g 的亞硝酸鈉），分別置于 25ml 具塞比色管中。 分別加入4.5ml 氯化銨緩沖溶液，2.5ml60 %的乙酸，然后立即加

5、入 5.0ml 顯色劑，加 水至刻度，混勻，在暗處靜置 25min，用 1cm 比色杯（靈敏度低時可換 2cm 比色杯），以 零管調節零點，于波長 550nm 處測吸光度，繪制標準曲線。吸取 10.0ml 樣品濾液于 25ml 具塞比色管中，按標準曲線制備程序，自“分別加入 4.5ml氯化銨緩沖液”起依法操作。同時做試劑空白。1 .4 結果計算式中：X樣品中亞硝酸鹽的含量，mg/kg;m1樣品的質量，g；m2測定用樣液中亞硝酸鹽的質量，卩 g;V1樣品處理液的總體積，ml；V2測定用樣液體積，ml。結果以算術平均值的二位有效數字表述。1.5 說明及注意事項硫酸鋅溶液作為蛋白質沉淀劑使用，也可用

6、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合溶液， 利用產生的亞鐵氰化鋅與蛋白質共沉淀；實驗中使用重蒸水可以減少試驗誤差。2 硝酸鹽的測定2.1 原理樣品經沉淀蛋白質、除去脂肪后，將樣品提取液通過鎘柱，使其中的硝酸根離 子還原成亞硝酸根離子。在酸性條件下，亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽 酸萘乙二胺偶合形成紅色染料，經比色測得亞硝酸鹽總量，從還原前后亞硝酸鹽量即 可求得硝酸鹽的含量。2.2 儀器和試劑(1)鎘柱a.海綿狀鎘粉的制備：投入足夠的鋅皮或鋅棒于 500ml200g/L 的硫酸鎘溶液中， 經 34h,當溶液中的鎘全部被鋅置換后，用玻璃棒輕輕刮下，取出殘余鋅皮，使鎘沉 底，傾去上層清液，以蒸餾水用傾斜

7、法洗滌，然后移入組織搗碎機中，加500ml 水。搗碎約 2s，用水將金屬細粒洗至標準篩上，取 2040 目之間的部分。置試劑瓶中，用 水封蓋保存，備用。b.鎘柱裝填：如圖 8 3 所示。用蒸餾水裝滿鎘柱玻璃管，并裝入 2cm 高的玻璃棉 作墊。將玻璃棉壓向柱底， 并將其中所包含的空氣全部排出， 在輕輕敲擊下加入海綿 狀鎘至 810cm高，上面用 1cm 高的玻璃棉覆蓋，上置一個儲液漏斗，末端穿過橡皮 塞與鎘柱玻璃管緊密連接。宀 83 鎘柱裝置示意圖日如無上述鎘柱玻璃管，也可用 25ml 酸式滴定管代用。rt ft 1.0-1.5mm當鎘柱填裝好后，先用 25ml 鹽酸(0.1mol/L)洗滌，

8、再以蒸餾水洗 2 次，每次，隨時都要保持水平面在鎘層之上，不得使鎘層夾有氣泡。完畢后，應先以 25ml 鹽酸(0.1mol/L)洗滌，再以水洗 2 次，每次 25ml，1氨緩沖溶液(pH9.69.7):量取 20ml 鹽酸加 50ml 蒸餾水，混勻后加 50ml氨水，用水定容至 1 000ml。2稀氨緩沖溶液：取 50ml 氨緩沖溶液，用水定容至 500ml。3對氨基苯磺酸溶液(4g/L)。4鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)。5鹽酸溶液(0.1mol/L):吸取 8.4ml 鹽酸，用水稀釋至 1 000ml。6硝酸鈉標準儲備液：準確稱取 0.123 2g 硝酸鈉(已于 110120C干燥至恒重,相

9、當于 0.1000g 亞硝酸鈉)，以重蒸水溶解，移于 500ml 容量瓶中并定容。此液濃度為 200卩 g/ml 亞硝酸鈉。用水覆蓋鎘柱。壬7硝酸鈉標準使用液：臨用時吸取標準液2.50ml 置于 100ml 容量瓶中，加水定容。此液濃度為 5 卩 mg/ml 亞硝酸鈉。8亞硝酸鈉標準使用液同亞硝酸鹽的測定。2.3 操作步驟。同亞硝酸鹽測定。1先以 25ml 稀氨緩沖溶液沖洗鎘柱，流速控制在 35ml/min(以滴定管代替 的，可控制在 23ml/min)。2吸取 20ml 硝酸鈉標準使用液，加入 5ml 稀氨緩沖溶液，混勻，注入儲液漏 斗，使流經鎘柱還原，以原燒杯收集流出液，當儲液中溶液流完后

10、，再加 5ml 水置換 柱內留存溶液。將全部收集液如前經鎘柱再還原一次，第二次流出液收集于 100ml 容 量瓶中，再用 20ml水洗滌鎘柱，共洗滌 3 次，洗滌液收集于同一容量瓶中，加水至刻 度，混勻。3吸取 10.00ml 還原后的標準液(相當于 10mg 亞硝酸鈉)于 50ml 比色管中，加 人2.0ml 對氨基苯磺酸溶液(4g/L),混勻，靜置 35min,各加入 1.0ml 鹽酸萘乙二胺 溶液(2g/L)，加水至刻度，混勻，靜置 15min，用 2cm 比色杯，于 538nm 處測定吸光度 并繪制標準曲線。根據標準曲線計算測得結果。還原效率大于 98%為符合要求。式中：X還原效率，;

11、A測得亞硝酸鹽的含量，卩 g;10 測定用溶液相當于亞硝酸鹽的含量，卩 g。1樣液還原：吸取 20ml 樣品處理液于 50ml 燒杯中，加 5ml 氨緩沖溶液，混勻 后注入儲液漏斗中，使流經鎘柱還原，以下按鎘柱還原效率測定操作進行，收集還原 后的樣液于100ml 容量瓶中并定容。2吸取 1020ml 還原后的樣液于 50ml 比色管中，以下按鎘柱還原效率測定操 作進行，測得吸光度，從標準曲線上查出亞硝酸鹽量。吸取 40ml 樣品處理液于 50ml 比色管中，按亞硝酸測定操作進行，測定吸光度，從 標準曲線上查出亞硝酸鹽含量。2.4 結果計算式中：X硝酸鹽含量，mg/kg ；A1經鎘柱還原后測得的亞硝