1、    應用Fura-/AM檢測大鼠多形核中性粒細胞內游離鈣濃度        摘要：應用Fura-技術，檢測大鼠無菌性炎癥時腹腔多形核中性粒細胞(PMN)內游離鈣濃度(Ca2+i)及中藥錦燈籠苦味素B對其影響。結果：在靜息狀態下，PMN內Ca2+i為(319.43±189.05)nmolL，酵母多糖激活可使Ca2+i成倍增加，兩者相比P0.05。中藥可抑制Ca2+i增加。各組之間差異顯著(P0.05)。并探討了Fura-檢測PMN內Ca2+i的可行性及證明中藥可抑

2、制Ca2+i。關鍵詞：鈣離子熒光指示劑；Fura-；中性粒細胞；鈣離子；錦燈籠苦味素B Using Fura-/AM to Examine the Concentration of Free Calcium in PMN of RatYang BingHe JiyuanLv Huan(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)ABSTRACT: Using Fura- technique, examine the concentration of free calcium in rat celiac p

3、olymorphonuclear neutrophile granulocyte (PMN) under aseptic inflammation condition and the effect of bitter principles B of the Chinese lantern-plant on it. Results: In resting state, the Ca2+ in PMN was 319.43+189.05nmol/L, the activation by zymosan could increase the Ca2+ remarkably, P<0.05. T

4、he Chinese medicine can inhibit the increase of Ca2+. Differences between the groups were apparent, P<0.05. The feasibility of using Fura- to examine Ca2+ in PMN was discussed as well and it proved that the Chinese Medicine could inhibit Ca2+.KEY WORDS: Calcium fluorescent indicator; Fura-; Neutr

5、ophile granulocyte; calcium; Chinese lantern-plant; Bitter principles B.Fura-是近年來發展起來的新一代鈣離子熒光指示劑，可用于細胞懸液、培養細胞、完整組織及單個細胞Ca2+i的測定13。多形核中性粒細胞(polymorpho nuclear leukocyte,PMN)是機體防御感染的屏障，是炎癥過程中的主要殺傷細胞。錦燈籠常用于上呼吸道感染性疾病，臨床效佳，苦味素B(physalin B,phB)為其主要成分。本文從方法學上探討了用Fura-測PMN內Ca2+i的可行性以及觀察中藥單體phB對其影響，并對機理進行了初

6、步分析。1材料和方法1.1藥品與試劑Fura-/AM，中國醫學科學院藥物研究所產品，用DMSO溶解成1mmol/L貯備液，-20避光保存；RPMI-1640培養液，用2.08g粉末(日水制樂株式會社提供)加小牛血清白蛋白(Sino-American Biotec Bpo315,From BM)0.2g，溶于200mL超純水，調pH 7.4后高壓滅菌，4保存。酵母多糖(Zymosan A)購自SIGMA公司；Trito-100由北京中醫藥大學組胚教研室提供；Hepes購自Woodland,USA公司；錦燈籠注射液由北京中醫研究所提供，其他藥品為市售分析純，溶液均為超純水配制。1.2調理酵母多糖的

7、制備將100mg酵母多糖加入10mL D-HanKs溶液中，煮沸30min,2 000r/min離心10min,棄上清，沉淀物加血清10倍(用D-Hanks液15稀釋)覆蓋，37恒溫振蕩水浴孵育30min，用D-Hanks液洗2次，加至5mL(終濃度20g/L)，-30冰箱保存。1.3細胞懸液的制備Wistar大鼠，雌雄不拘，200g左右，腹腔注入2%糖原溶液8mL，68h后乙醚麻醉(心臟取血，待分離血清備用)用冰Hanks液沖洗腹腔3次，洗出液800r/min離心5min，棄上清，反復洗3次。若有紅細胞則加Tris-NH4Cl液洗12次。將細胞懸浮在5mL RPMI-1640液中，計數細胞。

8、用RPMI-1640調細胞濃度5×109/L，每支試管2mL。伊文氏藍染色，要求細胞存活率95%。將試管分為4組，正常組不加任何試劑，氯化鉀組、酵母多糖組分別加200L氯化鉀溶液和200L調理酵母多糖。中藥組加入2.5L錦燈籠注射液，37恒溫振蕩水浴孵育10min,用D-Hanks液洗2次，加入2mL RPMI-1640，酵母多糖200L。1.4Fura-負載及熒光測定上述各試管細胞懸液加入Fura-/AM(終濃度為5 mol/L),37恒溫振蕩水浴孵育30min，D-Hanks液洗2次，調細胞懸液為5×109/L。測定前細胞預先于37復溫23min。MF-4 HITACH

9、I分光光度計熒光測定。測定條件：激發光柵5nm，發射光光柵10nm，以300400nm掃描激發光譜(峰值360nm，說明Fura-已負載進入細胞內)，固定激發光波長340nm，發射光波長490nm，觀察不同實驗條件下熒光強度的變化。由下式計算出Ca2+i：<"g37 (824 bytes)" src="/med/cano/201003/20100325162020318" 150 43>其中，kd為Fura-與Ca2+反應的解離常數，為224nmol/L；F為不同實驗條件下的熒光強度：Fmax為最大熒光值，由加入Triton-X100(終濃度

10、為0.1%)測得；Fmin為最小熒光值，由加入100L 0.1mol/L EGTA(pH8.5)測得。2結果酵母多糖組使PMN細胞內Ca2+i增加顯著，(P0.05)。中藥組有降低Ca2+i的趨勢，氯化鉀組作用不明顯。應用方差分析，組間差異F值3.61，有統計學意義(P0.05)。應用Q檢驗，酵母多糖組與正常組、酵母多糖組與氯化鉀組Q值分別為4.02、4.08均P0.05(見表1)。表1應用Fura-/AM對炎癥大鼠PMN細胞內游離鈣濃度的測定結果(nmol/L; <"xx1 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/201003

11、25162020123" 12 14>±s)組別n游離鈣離子濃度正常組4319.43±189.05氯化鉀組6309.14±253.01酵母多糖組5971.31±612.84*中藥組6629.06±282.28     注：與正常組比較*P0.05；與氯化鉀組比較P0.053討論細胞內鈣的變化是細胞內一種有效信號，通過測定細胞內游離鈣的含量及藥物治療后的改變，可提供它與疾病間關聯的直接證據和闡明藥物作用的機制和環節4。加入氯化鉀激活劑，當有細胞外鈣存在時，可使熒光強度發生變化1。本實驗以無鈣

12、D-Hanks液懸浮，結果并未使Ca2+i增加，從側面說明高鉀系通過打開電壓依賴性鈣通道，使鈣內流增加。但是，細胞效應與細胞內各種離子如Ca2+、K+、Cl-等及其濃度有關，D-Hanks液有各種離子，加入的氯化鉀溶液可能使一些離子發生跨膜轉運，從而間接使細胞內Ca2+i發生變化。此外，PMN是炎癥病理狀態下的細胞，其本身Ca2+i與正常生理狀態下應該有異，其膜上各種通道狀態如何，還未有實驗給予解釋。加入酵母多糖，具有明顯激活作用，可激活替代補體途徑，激活PMN。此時已屬離體實驗，只能靠細胞內物質的反應。PMN在激活狀態下Ca2+i升高，推測可能通過細胞內的鈣貯池及細胞器的鈣離子通道開放，Ca

13、2+依其與細胞內的Ca2+梯度經被動轉運由鈣貯池及細胞器釋放至細胞內。或者Ca2+從細胞內的結合部位釋放5。加入中藥錦燈籠苦味素B，雖無統計學意義，但有降低Ca2+i的趨勢。其抗炎機理有可能是抑制PMN的激活，從而引起Ca2+i的降低。錦燈籠苦味素B作用可能是抑制了PMN活化時氧自由基的產生，但氧自由基的活性與Ca2+濃度之間是何關系，尚須進一步實驗論證。作者簡介：楊冰，女，26歲，醫學碩士，助教作者單位：北京中醫藥大學北京100029參考文獻1李明，王峻峰，韓濟生，等.應用Fura-/AM檢測分離的神經細胞內游離鈣及其變化.藥學學報，1991，26(12)：8908942Grynkiewioz G etal Anew generation of Ca2+ indicators with greatly improred duorescence properties.J Bio