1、反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿及膀胱中阿霉素的濃度張宏文 錢立新 王蔚青 錢 靖 歐 寧 邵志高南京醫科大學第一附屬醫院 (南京 210029摘 要 :目的 建立測定血漿及膀胱組織中阿霉素含量的反相高效液相色譜法 。初步應用于膀胱癌患者膀胱內灌注阿 霉素預防膀胱腫瘤術后復發的療效觀察 。 方法 血漿中樣品用二氯甲烷 2異丙醇混合液提取 , 膀胱組織制成勻漿后經二氯甲 烷 2異丙醇混合液提取 ,Hypersil ODS 柱 (416mm 200mm ,10m 為分析柱 , 甲醇 20101m ol L -1磷酸二氫鉀 2冰醋酸 (8515 015 為流動相 , 檢測波長為 E 475nm X

2、、 E 545nmM , 以柔紅霉素為內標 。 結果 血漿及膀胱組織中阿霉素的線性范圍分別為 10300ng ml -1和 011110g g -1, 日內 、日間誤差 RSD 均小于 10%, 平均回收率分別為 104139%和 94152%。 結論 本法測定血漿及膀 胱組織中阿霉素含量準確 、 簡便 , 適用于阿霉素藥代動力學的研究 。關鍵詞 :高效液相色譜法 ; 阿霉素 ; 血藥濃度 ; 膀胱組織in H um an Plasm a and B ladderHPLC with Fluorescence DetectorZHANG H ong 2w en , QIAN Li 2xin ,

3、WANG Wei 2qing , QIAN Jing ,Ou Ning , SHAO Zhi 2gaoThe Fir st Affiliated Hospital with Nanjing Medical Univer sity (Nanjing 210029, China ABSTRACT :AIM T o establish an analytical method for the determination of adriamycin in human plasma and bladder by HP LC with fluorescence detector. METH OD Adri

4、amycin in plasma was extracted with mixture of dichloromethane and is opropyl alcohol. The ho 2m ogenate tissues sam ples were plunged into dichloromethane is opropyl alcohol and adriamycin was extracted. A Hypersil ODS column was usedwith a m obile phase of methanol 20101m ol L -1phosphate bu ffer

5、s olution 2acetic acid (85 15 015 ,the detective wavelength was E 475nm X,E 545nmM and daunorubicin was used as the internal standard. RESU LTS The calibration curve was linear within the range of 10300ng ml -1,and 011110g g -1in plasma and bladder ,respectively. The inter 2day and intra 2day RSD wa

6、s less than 10%,the recovery was 104139%and 94152%respectively. CONC L USION The method is sim ple with high sensitivity and g ood precision and has proved to be suitable for phar 2macokinetic studies of in adriamycin.KE Y WOR DS :HP LC ;Adriamycin ;Plasma concentration ;Bladder 阿霉素 (Adriamycin ,ADM

7、 是一種抗腫瘤譜廣 、 活性強 、 臨床上廣泛使用的蒽環類細胞毒抗生素 , 但 它具有明顯的毒副作用 , 最顯著的是心臟毒性和骨 髓抑制 1。膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的腫 瘤 , 且復發率高 , 局部化療成為重要的治療和防止復 發的方法 ; 而異博定作為增效劑可使化療達到更為 理想的效果 2。 本研究建立的反相高效液相色譜法 測定血漿及膀胱組織中阿霉素含量的方法將用于研 究異博定對阿霉素的增效作用 。1 儀器與試藥Waters 液相色譜儀 (包括 474熒光檢測器 ,515泵 ,Rheodyne 7725i 進樣閥 ; 上海分析儀器廠 ;N2000色譜工作站 (浙江大學儀器廠 ; 勻漿器

8、; 8022離心 機 。阿霉素對照品 (中國藥品生物制品檢定所 , 標示 量 9613% ; 內標 :柔紅霉素 (西安制藥廠 。乙腈 、 甲醇均為色譜純 (上海化學試劑廠 ; 冰醋4 江蘇藥學與臨床研究 2006年第 14卷第 1期通訊作者 T el :02528371883626362酸 、 磷酸二氫鉀 、 異丙醇均為分析純 。 2 方 法 211 色譜條件色譜柱 :Hypersil ODS 柱 (415nm 200nm , 10m ; 流動相 :甲醇 20101m ol ml -1磷酸氫二鉀 2冰醋酸 (85 15 015 pH 415; 流速 :1ml min -1; 檢測波長 :E 4

9、75nm X、 E 545nm M ; 進樣量 :20l 。 212 對照品溶液及內標溶液的配制精密稱取阿霉素 0100501g 于 10ml 量瓶中 , 用甲醇溶解并稀釋至刻度 , 搖勻 , 精密量取 012ml 于 10ml 量瓶中 , 以甲醇溶解并稀釋至刻度 , 配制 10102g ml -1阿霉素對照品溶液 。甲醇作為溶劑進一步 稀釋 , 制得不同濃度系列對照品溶液 。精密稱取內 標柔紅霉素約 10mg , 置于 100ml 量瓶中 , 解并稀釋至刻度 , , 取 110ml 中 , , -溶液 。 4。 213 樣品處理血漿樣品預處理 離心試管加入肝素抗凝血漿110ml , 精密加入

10、 10g ml -1內標溶液 20l , 混勻 ,加二氯甲烷 2異丙醇 (9 1 5ml , 渦旋混勻 2min ,4000r min -1離心 15min , 取 4ml 有機層于 40 水浴揮干 , 殘渣用甲醇 50l 溶解 , 取 20l , 作 HP LC 測定 。膀胱組織樣品預處理 取膀胱組織 015g , 加磷 酸鹽緩沖溶液 (pH 718 110ml , 勻漿器勻漿 , 加內標 溶液 (10g ml -1 20l , 加二氯甲烷 2異丙醇 (9 1 5ml , 在快速混合器上旋振 2min 、 以 4000r min -1離心 15min , 取 4ml 有機層于 40 水浴揮干

11、 , 殘渣用甲醇 50l 溶解 , 進樣 20l , 作 HP LC 測定 。 3 結 果 3. 1 按 項 和內標的組織 , 作 HP LC 分析 , 所得色譜見圖 1。在上述色譜條件下 , 阿霉素與內標分離 , 空白血 漿和膀胱組織對樣品測定無干擾 , 故本法具有良好 的專屬性 。圖 1 血漿及膀胱組織中阿霉素 HP LC 色譜圖A :空白血漿 ;B :標準含藥血漿 ;C :空白膀胱組織 ;D :標準含藥膀胱組織 (阿霉素 t R =8142m in ; 內標 t R =10134m in 3. 2 標準曲線于離心試管中加入空白血漿 1ml , 加入不同量的阿霉素標準溶液 , 使阿霉素濃度

12、分別為 10、 20、 50、 100、 200、 300ng ml -1, 按 “ 血漿樣品處理” 項下操作 , 記錄內標及樣品峰面積 A i 和 A s 。以阿霉素及內標 峰面積之比 A s /A i 為縱坐標 (Y , 血藥濃度為橫坐 標 (X 作回歸分析 。 回歸方程為 :Y =010042+010038X (r =019994, n =5 , 阿霉 素最低定量濃度為 5ng ml -1。取膀胱組織 015g 加入一系列濃度的鹽酸阿霉素標準液 , 使組織中阿霉素濃度分別為 011、 012、014、 016、 110g g -1, 按 “膀胱組織預處理” 項下操 作 , 記錄內標及樣品

13、峰面積 A i 和 A s 。以阿霉素及 內標峰面積之比 A s /A i 為縱坐標 (Y , 血藥濃度為 橫坐標 (X 作回歸分析 。 回歸方程為 :Y =010038+010854X (r =019982, n =5 。 313 精密度試驗按 “ 312” 項方法配制 300、 100、 20ng ml -1高 、 中 、 低 3種濃度的含藥血漿 , 按 “血漿樣品預處理” 項下 步驟作 1天內和連續 5天的測定 , 記錄峰面積 。結5 江蘇藥學與臨床研究 2006年第 14卷第 1期果見表 1。表 1 血漿中阿霉素的日內和日間變異 (n =5濃度 /ng m l -1日內A /A (x

14、s RSD (%日間125710877698 取膀胱組織 015g 制成阿霉素濃度分別為 011、014、 110g g -1的樣品 , 按“ 膀胱組織預處理” 項下操 作 ,1日內和連續 5天測定 , 結果見表 2。表 2 膀胱組織中阿霉素的日內和日間變異 (n =5濃度 /ng m l -1日內A A (x s RSD (%日間11938401009414011964501105127314 回收率測定、 300ml -1, 11410g g -1的樣品 , 按 “ 和 “膀胱組織預處理” 項下操作 , 結果見表 3和表 4。表 3 血漿樣品中阿霉素的回收率 (n =5加入量 /ng m

15、l-1回收率RSD (%9910761967103表 4 膀胱組織中阿霉素回收率 (n =5加入量 /ng m l -1回收率x sRSD (%9752449460315 最低檢測限和最低檢測濃度按信噪比 3倍計算 , 本法血漿及膀胱組織中最低檢測濃度分別為 5ng ml -1和 0105g g -1。 4 討 論參考文獻 3, 在流動相配比中 , 增加了甲醇的含量 , 使 ADM 的保留時間前移 , 吸收增加 , 提高了方法 的靈敏度 。 用二氯甲烷 2異丙醇 (9 1 的混合液提取 血漿和膀胱組織中阿霉素較文獻報道的氯仿 2甲醇 (4 1 的混合液提取 , 干擾峰少 , 混合時間短 , 提

16、取效 率高 。 采用內標法 , 克服了在阿霉素提取過程中可 能引起的操作誤差和測定時存在的不穩定因素 。 用 , 因而為了測出微 , , , 并減少 ADM 的破壞 , 加入磷酸鹽緩 沖液的量要適宜 (過多過少均不利于 ADM 的提取 。 本方法對文獻的方法進行了改進 , 改進后的方法具 有靈敏度高 、 快速簡便的優點 , 為研究膀胱灌注術后 阿霉素在體內的藥物濃度及異博定對 ADM 的增效 作用 , 提供了方法學基礎 。有關該方法的臨床應用 將另文發表 。參 考 文 獻1 陳新謙 , 金有豫 , 湯 光主編 . 新編藥物學 M.第 15版 , 北京 :人民衛生出版社 ,2003:67867912 王洪亮 , 趙忠文 , 姜鳳鳴 . 異博定對塞替哌及阿霉素在人膀胱癌細胞株體外化療的增效作用 J.白求恩醫科大學學報 ,1997, 23(5 :51751913 何素梅 , 魏樹禮 , 吳傳斌 , 等 . 反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿或肝組織中阿霉素含量 J.藥物分析雜志 ,1994, 14(4 :8111 信 息國家食品藥品監督管理局聽證規則 (試行 (局令 23號 發布 為規范國家食品藥品監督管理局行政許可 、 行政處罰 、 行政立法 、 行政決策等行政行為 , 保護公民 、 法人和其他組織的合法權益 ,2005年 12月