1、基因工程是在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。 第一部分 基因表達 基因工程的主要內容或步驟 1、 從復雜的生物有機體基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。（切） 2、 在體外，將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能自我復制的并具有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子。（連） 3、 將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（寄主細胞），并與之一起繁殖。（轉、篩） 4、 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。（擴） 5、 從這些篩選出的受

2、體細胞克隆，提取出已經得到擴散的目的基因，供進一步分析研究使用。 6、將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產出人類所需要的物質。 外源基因在原核細胞中的表達 外源基因在真核細胞中的表達 常用載體：1. Prokaryotic expression vector 原核表達載體 2. Baculovirus expression vector 昆蟲桿狀病毒表達載體 3. Mammalian expression vector 哺乳動物表達載體 4. Yeast expression vector 酵母表達載體 5. Adenoviral and retrov

3、iral vector 腺病毒及逆轉錄病毒表達載體 外源基因具備的條件：1.編碼區(qū)不含插入序列；（mRNA-cDNA）2.位于啟動子下游，方向一致，原有的讀碼框不變；3.含起始密碼子、終止密碼子；4.轉錄出的mRNA必須有SD序列，調整SD序列與第一個AUG間的距離（因為會對轉譯效率有影響）；5.產物比較穩(wěn)定（如：融合蛋白、信號肽）；6.選擇系統(tǒng)偏好的簡并密碼。影響外源基因表達的因素： 1.啟動子的強弱（主要因素） 2.基因的劑量3.RNA轉譯效率（SD互補、AUG-SD距離及序列、AUG前后核苷酸序列的適宜性）4.密碼子5.表達產物的大小6.產物的穩(wěn)定性受體細胞的選擇不同類型的細胞具有不同的

4、特征，對要表達的外源基因具有不同的適應性。如：CHO細胞、CV-1或NIH-3T3選擇標記特定細胞、選擇標記、選擇性培養(yǎng)基特定的選擇系統(tǒng)。常用的：胸苷激酶基因、二氫葉酸還原酶基因、新霉素磷酸轉移酶基因選擇系統(tǒng)等。導入細胞：轉化（transformation):指質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入原核生物里面的過程。轉染(transfection):指病毒或以它為載體構建的重組子導入真核細胞的過程。轉導(transduction):轉導是指通過病毒將一個宿主的DNA轉移到另一個宿主的細胞中而引起的基因重組現(xiàn)象。（狹義：指以噬菌體為載體，在細菌之間轉移DNA的過程。）導入細胞的方法：重組體

5、導入細胞的方法 哺乳動物細胞 （磷酸鈣沉淀 顯微注射 脂質體 DEAE-dextran ）酵母菌電轉 大腸桿菌 CaCl2法制備感受態(tài)細胞，熱攻擊法轉化 重組蛋白的誘導表達及檢測：1.IPTG誘導2.溫度誘導3.檢測:SDS-PAGE電泳第二部分 蛋白質的純化 蛋白質的分離純化的一般原則一、原料的選擇：富集于哪種組織、細胞；胞外or胞內表達。組織和細胞的破碎方法：勻漿、電動搗碎、超聲破碎、反復動融。細菌、酵母、哺乳動物細胞二、粗分：簡單、易處理、快速。如利用蛋白質溶解度不同，在不同pH值下，不同飽和度的硫酸銨沉淀；有機溶劑分級沉淀；分級離心等。三、精制備 ：離子交換層析、分子篩、吸附層析、親核

6、層析、電泳、離心、結晶以及一些免疫的方法。 注意保持生物活性，如pH值、溫度、加入酶的抑制劑、金屬離子絡合劑（EDTA）等。 蛋白質的分離純化技術 ：1.溶解度差別2.分子大小不同3.蛋白質分子帶電性質不同4.蛋白質吸附性質不同5.蛋白質的特異性配體原理應用 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL)的表達、純化和抗腫瘤活性研究技術路線 引物設計 表達載體 ：TRAIL全基因及可溶型sTRAIL基因PCR擴增 提取正常人外周血淋巴細胞總RNATRAIL全基因的獲得以該總RNA為模板，用寶生物公司的BeaBEST 反轉錄試劑盒進行反轉錄。以該反轉錄產物為模板，加入引物P1，P2進行第一次PCR。

7、sTRAIL基因的獲得以TRAIL全基因經純化的PCR產物為模板，加入引物P1，P2，再次PCR sTRAIL基因，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。含腸激酶位點的pThioHisA-sTRAIL表達載體的構建 純化后的TRAIL、sTRAIL PCR產物用BamHI、EcoRI雙酶切。質粒pThioHisA用同樣的酶雙酶切，膠回收酶切片段，T4 DNA連接酶分別連接經雙酶切的片段TRAIL、sTRAIL和質粒載體，轉化宿主菌BL21，篩選陽性克隆。小提質粒，酶切鑒定重組子，并對重組子進行測序分析。誘導表達 pThioHisA-sTRAIL在大腸桿菌BL21中的誘導表達。3.0 mmol/L IPTG

8、誘導6-8 h，表達達到高峰，經薄層掃描目的蛋白約占菌體總蛋白的39左右。表達產物部分可溶，其余形成包涵體。融合表達產物SDS-PAGE表觀分子量為32000 Dalton左右（實際分子量為35608.21 Dalton）。sTRAIL融合蛋白的制備 工程菌的培養(yǎng)：挑取陽性克隆，接種于200mL含100g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜。然后以10-20的接種量擴大培養(yǎng)，IPTG誘導。超聲破碎菌體：離心收獲的菌體按0.2g/mL重懸于A液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.2mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)，冰浴中超聲破碎。12,000rpm/min離心

9、15min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析目的蛋白以可溶性還是以包涵體形式存在。sTRAIL融合蛋白的純化 1.融合表達載體pThioHisA在硫氧還蛋白融和段帶有組氨酸標簽，用Ni2+固相化的Chelating Sepharose Fast Flow填料進行親和層析。2.將可溶性表達產物（超聲破碎菌體的離心上清）與親和柱結合，用2倍柱床體積以上的A液過柱，至基線平穩(wěn)；用B液 (A液中加入咪唑至終濃度為50mmol/L) 梯度洗脫510個柱體積，用AKATA Explore進行檢測，收集各洗脫峰。sTRAIL融合蛋白的腸激酶切割及純化 1. sTRAIL融合蛋白的腸激酶切割：按sTR

10、AIL融合蛋白：腸激酶不同體積的比例酶切，SDS-PAGE分析。2.sTRAIL非融合蛋白的純化：以A液（25mM pH7.0的磷酸緩沖液）平衡 SP Sepharose Fast Flow離子交換柱，將酶切后的反應液直接上柱，以B液（25mM pH7.0的磷酸緩沖液0.6M NaCl）梯度洗脫，收集洗脫峰，以分離除去融合頭。其中的目的峰再用分子篩Sepharyl S-200做進一步純化及脫鹽處理。用Bradford法測定蛋白質濃度，SDS-PAGE分析檢測。sTRAIL融合蛋白及非融合蛋白的 Western Blot檢測第一抗體：兔抗人TRAIL多克隆抗體，1:1000稀釋； 第二抗體：HR

11、P標記的羊抗兔IgG抗體，1:10000稀釋。 新基因功能研究的策略與方法基因功能的研究策略主要包括：一.新基因的生物信息學及體內表達規(guī)律分析;二.新基因的體內表達規(guī)律分析三.功能獲得與功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因編碼產物相互作用蛋白的研究一.新基因的生物信息學及體內表達規(guī)律分析目前，生物信息學分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷和經濟等優(yōu)點。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關的重要信息，初步推測基因的可能功能，進而制定出進一步的實驗室研究方案。（1）編碼產物預測分析（2）序列同源性分析（3）蛋白質功能域分析二.新基因的體內表達規(guī)律分析要開展新基因功能的研究

12、工作，首要的研究任務摸清新基因在體內的表達規(guī)律。包括從mRNA和蛋白質兩個水平上來對其基因表達譜進行分析，即看其在各種不同的正?；虿B(tài)組織細胞中是否表達以及表達的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細胞中的表達水平高往往提示其在其中發(fā)揮著重要作用，而新基因在相應的病態(tài)組織中的表達異常則提示與該病理過程相關的生物學意義。（1）mRNA水平的表達譜分析；（2）蛋白質水平的表達分析。三.功能獲得策略新基因功能研究的功能獲得策略即通過將新基因直接導入到某一細胞或個體中，通過觀察細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化來鑒定基因的功能，常用的方法有：（1）基因轉染技術（2）轉基因技術四.功能失活策略通過

13、觀察某一細胞或個體在新基因的功能部分或全部失活后的細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀變化來鑒定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術和基因敲除等1）基因沉默技術（2）基因敲除五.基因編碼產物相互作用蛋白的研究細胞各種基本功能的完成離不開蛋白質之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質復合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質表達終產物相互作用的上下游蛋白質分子，也是研究新基因功能的一個十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質相互作用的技術包括傳統(tǒng)的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術和酵母雙雜交系統(tǒng).（1）免疫共沉淀技術（2）酵母雙雜交系統(tǒng)編碼產物預測分析研究者往往最開始得到有價值的EST

14、序列，進而通過電子延伸或和相關實驗方法獲取其全長cDNA序列。這種情況下，首先要進行即是進行全長cDNA序列的開放閱讀框查找，推導其編碼蛋白質的氨基酸序列。 然后，進行信號肽序列預測分析。初步判定其亞細胞定位，再進行蛋白質的基本理化性質分析，包括氨基酸組成、分子質量、等電點、親/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基礎，分析預測其高級結構。序列同源性分析包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學技術中應用最為廣泛的基本技術之一。主要采用BLAST和FASTA程序進行，即從已知的各種核酸和蛋白質序列數據庫搜索與新基因對應的功能已知的高度同源基因和蛋白質，從這些已知基因和

15、蛋白質的功能信息中來初步推測和判斷新基因的功能。 同時，因為人類全基因組測序已經完成，所以以新基因的cDNA序列來對基因組數據庫進行同源性比對，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA序列及其染色體定位信息，而無需進行熒光原位雜交等基因染色體定位技術，進而還可通過分析其內含子、外顯子序列及其調節(jié)位點，推測其可能的基因表達調控方式。即通過此法確定了富含亮氨酸重復序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。蛋白質功能域分析主要是通過聯(lián)網或數據庫行蛋白質是基因功能的體現(xiàn)者和施行者，而蛋白質的結構則是蛋白質執(zhí)行生物學功能的基礎，因此對新基因所編碼蛋白質的功能域分析將對推測新基因功能提供極其有價值的

16、信息。目前，已經有大量被發(fā)現(xiàn)的蘊藏于蛋白質結構中的與特定生物學活性相關的所謂保守模體mRNA水平的表達譜分析對新基因在mRNA 水平上的表達分析涉及到的技術有半定量RT-PCR 、實時定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量RT-PCR方法具有簡便、快捷和經濟的特點，但其存在著精確度不高和不能進行絕對定量等缺點，多用于基因表達水平的快速初步分析。實時定量RT-PCR是近年來新發(fā)展起來的一種mRNA定量分析技術，因具有特異性更強、有效解決PCR污染和自動化程度高等的特點而被廣泛應用，但其成本相對較高。Northern Blot歷來是在mRNA水平上對基因表達進行分析的經典技術，

17、被各實驗室廣泛采用其不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測基因轉錄本的大小及種類，這也是RT-PCR技術所不具備的優(yōu)勢但Northern Blot操作較為繁瑣，采用放射性標記時也存在放射性污染的問題。在實際工作中，需結合這兩類方法同時進行，互為補充。另外，必要時也應考慮使用原位雜交技術來對新基因的mRNA在特定組織細胞內的分布進行定位觀察。蛋白質的水平表達分析 確定新基因在哪些組織細胞被轉錄后，進一步的工作則是制備相應的抗體來檢測其蛋白質終產物的表達情況，如該蛋白質表達的亞細胞定位、分子質量大小、聚體形式等。這種在蛋白質水平上的表達分析涉及到的常用技術主要是Western Blot和免疫組化等。

18、其中，Western Blot與Northern Blot類似，不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測蛋白質的分子質量大小及其聚體形式。而免疫組化技術的優(yōu)勢則在于其能夠確定蛋白質是在特定組織中的哪些細胞以及在特定細胞的哪個部位中表達。另外，對于病態(tài)組織細胞而言，在mRNA和蛋白質兩個水平上的新基因的表達分析，還可以提供其基因表達調控的大致規(guī)律，譬如是主要在轉錄水平還是在翻譯水平上被調控的。不少研究表明，細胞內特定基因的mRNA水平變化和蛋白質水平變化的一致性很差?；蜣D染技術 通過基因轉染，即將目的基因轉入某一細胞中通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能，是目前應用最多、技術最成熟的基因功

19、能研究方法。如經典的RAS癌基因的功能即通過轉染NIH-3T3細胞而得以鑒定目前常用的基轉染系統(tǒng)分為非病毒性表達系統(tǒng)和病毒性表達兩種，非病毒性表達載體目前主要采用質粒，通過脂質體介導、電穿孔等方法使目的基因被宿主細胞攝取，然而，盡管這類表達系統(tǒng)具有操作簡便、經濟等優(yōu)勢，其也有不少局限性，主要問題是，不同細胞類型對外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級未轉化的細胞中幾乎是無效的，而初級細胞對于觀察基因的細胞轉化活性等行為恰恰非常有用。然而，病毒性載體，尤其是逆轉錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問題，這類以病毒為載體介導的基因轉移因其具有轉染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達等優(yōu)勢而被廣泛應用。轉基因

20、技術利用轉基因技術，則可將外源基因引入動物體內，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉基因動物模型，通過對轉基因動物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經運用轉基因技術建立了數千種轉基因動物，并且還可以通過在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動子等手段，從而控制外源基因在特定的時間或特定的組織器官表達。利用轉基因動物來研究基因功能的優(yōu)勢在于它是一個在活體水平上的多維的研究體系，可以從分子到個體水平進行多層次、多方位的研究。基因沉默技術這類技術中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術。然而，包括這3種技術在內的該類技術均具有誘導干擾素和其它細胞因子表達等非特異性效應，另外，它們也會因為作用與和靶分子序列相近的分子而產生脫靶效應，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應最大；而RNAi的這兩種副效應最小基因敲除 或稱基因打靶，是建立在胚胎干細胞技術和同源重組技術基礎上的一種方法。既可以在細胞水平上進行，從而建立新的細胞系，也可以在整體水平進行以建立基因敲