1、    大腸桿菌分泌型載體表達重組人堿性 成纖維細胞生長因子        提要設計構建了帶有大腸桿菌外膜蛋白(OmpA)信號肽序列的重組分泌型表達載體pSE-hbFGF，在大腸桿菌DH5中分泌表達了重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)。SDS-PAGE、免疫印跡及生物活性測定均表明表達產物分泌到細菌細胞周質和培養基中。分泌到周質中的rhbFGF可占周質總蛋白的15%。關鍵詞hbFGF大腸桿菌分泌表達 SECRETION OF RECOMBINANT HUM

2、AN bFGFEXPRESSED BY E.coliYuan TaoZhang XuemeiHuang LinLi ChunyangWang JingWang JiyuanXu LiuJiang LimingWang YanWang ZhijieXu Xiuzhen(Chengdu Institute of Biological ProductsChengdu 610063)ABSTRACTHuman basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene was inserted into expression vector with OmpA signal

3、sequence and expressed in E.coli DH5. SDS-PAGE analysis, western-blot and bioassay verified that the expressed rhbFGF was secreted into culture medium and periplast of bacteria. The yield of rhbFGF secreting into periplast accounted for 15% of total periplast protein.Key WordshbFGFE.coliSecretionExp

4、ression堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是成纖維細胞生長因子家族中的一員，分子量為1618 kD，是一種具有調控細胞增殖、分化功能的蛋白分子，可促進創傷愈合、骨修復、眼晶體再生及肢體再生等，具有廣泛的潛在臨床應用價值；并有可能開發成為治療心肌梗塞、骨質疏松癥和老年性癡呆等多種疾病的藥物。由于分離和純化天然的人堿性成纖維細胞生長因子(hbFGF)來源有限，因此，研究開發基因工程重組人堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)就成了滿足基礎和臨床應用研究需要的唯一途徑。為此，設計構建了分泌型表達載體pSE-hbFGF在大腸桿菌脂蛋白啟動子和乳糖啟動子操縱子雙重控制下，在大腸桿菌DH5中分泌表達

5、了hbFGF基因。1材料和方法1.1菌株、質粒和細胞株含hbFGF cDNA的質粒pBluescript-hbFGF(自行構建)；大腸桿菌DH5、分泌型表達質粒pSE均由實驗室保存；3T3細胞株(中國生物制品檢定所)。1.2試劑限制酶EcoRI、BamHI及Taq酶、dNTP、DNA連接試劑盒、Dig標記與檢測試劑盒和NBT/BCIP顯色液均購自德國寶靈曼公司；質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒(美國Promega公司)；鼠源性抗hbFGF單克隆抗體、IPTG(Sigma)；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG/IgM(TAGO公司)；hbFGF生物活性檢測標準品(中國生物制品檢定所)；其余均為國產

6、分析純試劑。PCR擴增在PE9600擴增儀上進行。引物合成由美國賽百盛生物工程公司完成。1.3斑點雜交Dig標記探針的制備與斑點雜交操作過程均按寶靈曼公司的Dig標記與檢測試劑盒說明書進行。1.4分泌型表達載體的構建酶切、連接、轉化等基本操作均參照文獻1，2的方法略作修改。用斑點雜交法和酶切鑒別陽性克隆。1.5重組菌的誘導表達培養至對數的重組菌中加入IPTG誘導培養46 h。1.6SDS-PAGE電泳按Laemmli的方法進行2。1.7免疫印跡鑒定實驗參照文獻2的方法。1.8生物活性檢測用MTT法檢測樣品刺激3T3細胞增生的活性。2結果2.1引物的設計pSE分泌型表達載體部分前導肽及多克隆位點

7、處的序列分別為：根據文獻3報道的hbFGF cDNA序列，選擇EcoRI和BamHI作為插入位點，設計合成了以下一對引物。載體與hbFGF片段連接部位的核苷酸和氨基酸序列如下：保留了EcoRI酶切位點，成熟蛋白跨膜時將有1、2、3三個可能的信號肽識別切割位點。如果跨膜時從1位切割，成熟蛋白N端將多出Ala-Glu-Phe三個氨基酸；而從2、3位切割將得到N端少2或3個氨基酸的hbFGF。從文獻4報道看，N端少幾個到十幾個氨基酸對hbFGF的生物活性無影響。實驗結果已證明。2.2分泌型表達載體pSE-hbFGF的構建采用上述設計合成的引物，以含hbFGF cDNA的質粒pBluescript-h

8、bFGF為模板進行PCR擴增。擴增時的復性溫度為55。得到了約500 bp的擴增條帶(1)。利用兩種酶EcoRI和BamHI分別消化載體pSE和PCR擴增產物，經0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離后分別回收線狀質粒和PCR產物膠條，過柱純化后用寶靈曼公司的Rapid DNA ligation kit連接，然后轉化E.coli DH5，用Dig標記探針雜交篩選陽性重組子，經EcoRI和BamHI雙酶切證實插入片段大小正確(2)。構建過程如3。Fig 1Detection of PCR products1 500 bp ladder dsDNA marker2 480 bp PCR products3 N

9、egative template controlFig 2Electrophoresis pattern of restrictive fragments of recombinants plasmids1,2Plasmids containing insert fragments3 250 bp ladder dsDNA marker4,5 Plasmids without insertsFig 3Construction of recombinant secretion plasmid pSE-hbFGF2.3重組菌的誘導表達與鑒定根據表達載體的特點，hbFGF cDNA位于Lac操縱子片

10、段下游，因此，只有在Lac誘導劑存在時才能表達。將構建好的重組菌pSE-hbFGF/DH5接種于LB培養基中活化過夜后接種于HD培養基中培養到OD600為0.5時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，6 h后搜集菌液作SDS-PAGE和Western-blot鑒定。SDS-PAGE結果表明，在分子量約17 kD處的條帶明顯加深(4)。Western-blot鑒定確證在約17 kD處有特異表達產物(5)。Fig 4SDS-PAGE analysis of expressed product1pSE,IPTG induction for 6 h2-3 pSE-hbFGF,IPTG ind

11、uction for 5,6 h4 Protein low molecular standardFig 5Western-blot analysis of expressed product1 pSE,IPTG induction for 6 h2 pSE-hbFGF,IPTG indution for 6 h3 Protein low molecular weight standard2.4hbFGF基因表達產物的定位將發酵培養誘導菌液6 000 g離心10 min，分別收集上清和菌體。菌體加入新配制的高滲緩沖液，內含溶菌酶(1 mg/ml)、20%(w/v)蔗糖、30 mmol/L Tri

12、s-HCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)，冰浴振搖10 min，6 000 g離心20 min，收集上清為周質組分；沉淀重懸于0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中，反復凍融使細胞裂解，再以12 000 g離心5 min，上清為細胞質蛋白，沉淀部分為細胞膜組分和包涵體。對上述培養基上清、細胞周質、細胞質和膜碎片幾部份分別作SDS-PAGE電泳、免疫印跡和生物活性檢測，結果證明有活性的表達產物存在于細菌細胞周質和培養基中。SDS-PAGE檢測到的周質目的蛋白與我們預計的在前導肽2或3位切割的產物大小一致，約為17 kd。SDS-PAGE掃描結果表明

13、分泌至周質的rhbFGF約占周質總蛋白的15%。3討論文獻報道5及我們以前構建的表達rhbFGF的工程菌多為大腸桿菌胞質型表達，表達量都不高，加之rhbFGF水溶性較好，在胞質中表達時主要以可溶性形式存在，不形成包涵體，容易被胞內蛋白酶降解，活性不夠穩定，因此分離純化比較困難。分泌型載體表達外源蛋白具有以下優點。胞漿中的還原環境不利于形成二硫鍵，而在周質的氧化環境很容易形成，故表達產物能夠正確折疊；由于周質空間的蛋白酶水解活性較低，因此，分泌到此的蛋白更加穩定；通過滲透休克法7很容易將周質蛋白釋放出來，分離純化工藝相對簡單。OmpA是大腸桿菌的一種主要外膜蛋白6，實驗所用的pSE分泌型表達載體

14、中帶有一段編碼其信號肽的核苷酸序列，插入的外源基因能與之形成融合蛋白前體，移位跨膜時伴隨前導肽的切割，因此，只要插入的外源蛋白結構與信號肽匹配就可以將完整的外源蛋白分泌到細胞周質中和培養基中。利用帶OmpA信號肽序列的表達載體分泌表達外源蛋白時，目的蛋白最終分泌到什么位置，與目的蛋白的結構有關聯。有的分泌到培養上清和周質中，有的僅分泌到周質中，而水溶性不好的蛋白則會鑲嵌于細菌細胞膜上810。實驗結果表明有活性的hbFGF基因表達產物分泌到了細菌細胞周質和培養基中，說明hbFGF基因適合用該分泌表達系統進行表達，這為下游純化工作奠定了良好的基礎。pSE載體上含有表達Lac抑制因子的LacI基因，

15、因此Lac操縱子被封閉，當Lac誘導劑如IPTG加入培養基中才能使抑制因子失活，從而誘導克隆的目的基因表達。有效利用pSE載體上的LacI基因可以很好地控制目的基因的表達。我們在實驗中發現，在某些培養基如LB中誘導時，在未加誘導劑的情況下，已有rhbFGF的表達，這可能是因為這些培養基中的某些成分如酵母粉中含有Lac激活劑，可以在沒有IPTG的情況下就誘導克隆基因表達。為避免這種情況，可采取發酵過程中菌體培養階段用基礎培養基加酪蛋白水解物。作者單位：成都生物制品研究所成都 610063參考文獻1(美)J.薩姆布魯克，EF佛里奇，T曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓譯，侯云德校.分子克隆實驗指南.第2

16、版.北京：科學出版社出版，19922Frederick M Ausubel, Roger Brent, Robert E Kingston, et al.Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons Inc,19953Abraham JA, Wang JL.Tumolo A, et al.Human basic fibroblast growth factor:nucleotide sequence and genomic organization. EMBO(Eur.Mol.Biol.Organ.)J,1986,5

17、25234Ueno N, A Baird, Esch F,et al.Isolation of an amino terminal extended form of basic fibroblast growth factor. Biochem Biophys Res Commun,1986,1385805趙愛平，徐林，錢林法等.人堿性成纖維細胞生長因子基因在大腸桿菌中的克隆與表達.中國生化藥物雜志，1996，17(3)936Masayasu T, David WH, Philip JB,et al.The ompA signal peptide directed secretion of staphylococcal nuclease A by Escherichia coli.The Journal of Biological Chemistry,1985,260(5)26707Neu HC, Heppel LA. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J Bio Chem,1965,240