1、虎杖苷對燒傷血清和LPS作用下大鼠平滑肌細胞蛋白激酶C活性的影響(一)    作者：王月剛，金春華，黃海瀟，吳平生【關鍵詞】 虎杖苷基金項目：國家自然科學基金【Abstract】 AIM: To explore the mechanism of polydatin (PD) treating shock through studying the influence of PD on the activity of protein kinase C (PKC) of vascular smooth muscle cells (VSMC) when trea

2、ted by sera from burned rats and lipopolysaccharide (LPS). METHODS: After VSMC was treated by sera from burned rats or LPS, the activity of PKC was measured by scintillation counting instrument. RESULTS: Activity of PKC of VSMC cytoplasm after treated by sera from burned rats decreased (P0.05 vs nor

3、mal group), but activity of PKC of cell membrane increased (P0.05 vs normal group). When VSMC was treated with PD, the activity of PKC of VSMC cytoplasm increased and that of cell membrane decreased (P0.05 vs burned group and control group, P>0.05 vs normal group). However, the activity of PKC of

4、 VSMC cytoplasm and cell membrane treated by LPS increased (P0.05 vs normal group), after PD treated VSMC the activity of PKC decreased again (P0.05 vs LPS group and control group, P>0.05 vs normal group). CONCLUSION: PD antagonizes the damage effects of LPS and sera of burned rats by reversing t

5、he PKC activities, which may be one of the molecular mechanisms of PD antishock property.【Keywords】 burn; lipopolysaccharide; smooth muscle cell; polydatin; protein kinase C【摘要】 目的:觀察虎杖苷(PD)對燒傷血清和脂多糖（LPS）作用下大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）蛋白激酶C（PKC）活性的影響，探討其抗休克的機制. 方法:取大鼠胸主動脈培養VSMC，用燒傷血清和LPS刺激VSMC后，閃爍計數儀測定PKC活性. 結果：

6、 燒傷血清作用后VSMC胞質PKC的活性下降(vs正常組P0.05)，但胞膜的PKC活性上升（vs正常組P0.05），經PD治療后胞質PKC的活性上升（vs燒傷組、治療對照組P0.05，vs正常組P>0.05），胞膜的PKC活性下降（vs燒傷組、治療對照組P0.05, vs正常組P>0.05）. LPS刺激后VSMC胞質與胞膜PKC的活性均上升（vs正常組P0.05），經PD處理后其活性又均下降（vs LPS組、治療對照組P0.05，vs正常組P>0.05）. 結論： PD對燒傷血清和LPS作用下的VSMC的保護作用可能是通過調節PKC的活性來發揮作用的，這可能是其抗休克的分

7、子機制之一.【關鍵詞】 燒傷；脂多糖；平滑肌細胞；虎杖苷；蛋白激酶C0引言虎杖苷(polydatin, PD)是從中藥虎杖中提取的主要成份，在體動物實驗表明PD對燒傷性、感染性休克有良好療效，治療休克動物的存活時間和存活率均明顯優于6542和多巴胺1. 平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC)在小血管的收縮擴張中占據著主導地位，而蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）的活性則對VSMC的收縮功能起著重要的調節作用2. 對于感染性休克來講，細菌內毒素起了重要的作用，內毒素的主要成份為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，因此我們用LPS刺

8、激大鼠SMC來模擬感染性休克，同時，我們也應用燒傷血清刺激SMC來模擬燒傷性休克，觀察了PD在此種情況下對SMC PKC活性的影響，以探討PD抗休克的作用機制.1材料和方法1.1材料清潔級SD大鼠，40只，體質量180220 g，雌雄不拘，由南方醫科大學實驗動物中心提供. PD由校化學教研室提純制備. LPS(濃度2.5 g/L)，磷脂酰絲胺酸（phosphatidylserine, PS）,組蛋白S型（histone）,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）和Triton X100購自Sigma公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 32PATP

9、, ATP(250 mmol/L), CaCl2, MgCl2, DTT, Hepes, 蔗糖，TrisHCl, EGTA, EDTA, 烏拉坦, 氯醛糖等均為國產試劑. PD用DHanks液配制成2 mmol/L，避光保存. PS用氯仿配制成2 g/L，避光貯于-20. PMSF用異丙醇配制成100 mmol/L，-20保存. LS6500型液體閃爍計數儀（Bechman公司，測量PKC的活性），低溫高速離心機（Bechman Avanti J25, 提取PKC用）.1.2方法1.2.1大鼠主動脈SMC的培養3將大鼠斷頭處死，無菌操作取一段胸主動脈4，洗去血液，去除外膜纖維脂肪組織，用眼科剪

10、縱行剪開血管，刀片刮血管內膜23遍，然后將血管切成約1 mm×1 mm大小碎片，分裝貼入培養瓶中，加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培養基，倒置34 h后翻轉，于37 50 mL/L CO2的細胞培養箱中靜置3 d(靜置期間不許震動或移動培養瓶, 以防剛貼壁的組織細胞塊脫落)，然后每2 d換液. 一般47 d左右SMC從組織塊中爬出，23 wk出現致密細胞層. 待細胞快融合時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取38代細胞做實驗.1.2.2燒傷血清的制備成年SD大鼠30只，用133 g/L烏拉坦,5 g/L 氯醛糖麻醉，每100 g體質量0.6 mL劑量腹腔注射給藥. 將SD大鼠

11、固定在操作臺上，頸動脈插管(插管預先用肝素抗凝)，然后將大鼠雙下肢及髂前上棘以下的部分浸泡于80水中30 s，監測大鼠血壓直到40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）. 當血壓下降到40 mmHg時取大鼠全血，置于離心管中，靜置30 min，然后3000 r，10 min，收集上清即為大鼠燒傷血清，一般一只大鼠可取23 mL燒傷血清.1.2.3PKC的提取和測量1.2.3.1緩沖液的配制緩沖液A：將預先配制的EGTA, EDTA, DTT, Hepes, PMSF分別加25,20,0.2,25,1.2 mL，然后加入5.1345 g蔗糖，定容至100 mL. 緩沖液B (mL)：將預

12、先配制的Hepes 7.5, EDTA 12, EGTA 30, DTT 3混在一起，定容至60 mL. 以上兩種緩沖液用時臨時配制，貯存于4，使用期限1 wk. 層析柱的制作：稱取纖維素（DE52）3 g，溶于10 mL三蒸水中，1 h后去除上層的細小顆粒，然后再次加入三蒸水10 mL，如此重復三次，將DE52的細小顆粒去除. 然后將纖維素裝入1 cm×6 cm大小的層析柱，以備過濾時用. PKC的反應體系緩沖液：50 mmol TrisHCl (pH 7.5), 0.5 mmol CaCl2, 20 mmol MgCl2, 20 mg/L磷脂酰絲氨酸，50 mg/L組蛋白H1（S

13、型），1 mmol/L DTT, 50 mmol/L ATP, 5 mmol/L (32P)ATP.1.2.3.2提取和測量取培養38代的SMC，先用PBS離心沖洗兩次，再用細胞刮子輕輕刮下細胞，在冰冷狀態下置于低滲的緩沖液B中膨脹15 min（置于冰壺中）. 超聲粉碎儀粉碎細胞，一般35焦能量，打10次即可破碎細胞. 4下30 000 g，1 h，上清液即為PKC細胞質的提取物. 所得沉淀為胞膜，將含有5 mL/L Triton X100的緩沖液A加入其中，在冰壺中孵育30 min，4 12 000 g，10 min，所得上清液為細胞膜的粗提物. 然后用緩沖液B（容量為層析柱的容量）平衡DE

14、52層析柱，將PKC提取物置于DE52層析柱上. 首先用12倍于層析柱體積的緩沖液B洗滌，繼以等層析柱容量的含有0.05，0.10，0.20 mol/L NaCl溶液洗脫，把通過紫外分析儀波峰時的洗脫液收集起來即為PKC的提取物. 貯存于-20以備檢測. 將PKC提取物加入反應體系緩沖液中，置于30水中溫浴30 min，每管中加入50 L三氯乙酸終止反應. 終止后的反應體系加在硝基纖維素膜，負壓吸引器下用3 mL三氯乙酸溶液洗滌3次，濾膜放入液閃瓶中進行閃爍計數得出CPM值，然后通過公式計算出PKC的活性.1.3分組實驗分兩部分，一部分為燒傷血清刺激，一部分為LPS刺激，n=5. 燒傷血清刺激

15、分正常組（不加任何處理因素），燒傷組（大鼠燒傷血清刺激1 h，血清濃度為200 mL/L），治療組（在燒傷組處理完畢后加PD治療2 h，PD終濃度為0.4 mmol/L），治療對照組（在燒傷組處理完畢后加與PD等量的DHanks，作用2 h）；LPS刺激分正常組（未做任何處理），LPS刺激組（加入LPS使其終濃度為100 g/L，刺激30 min），治療組（在LPS刺激組基礎上加PD，終濃度為0.4 mmol/L，作用2 h），治療對照組（在LPS刺激組基礎上加與PD等量的DHanks，作用2 h）.統計學處理： 結果用x±s表示，應用SPSS 10.0統計軟件進行單因素方差分析.2

16、結果2.1PD對燒傷血清刺激后SMC胞質及胞膜PKC的影響胞質：燒傷組的PKC活性比先前有所下降，與正常組比較P0.05. 經PD治療后PKC的活性有所上升，與燒傷組比較P0.05，與正常組相比P>0.05. 而治療對照組的活性上升更高, 與燒傷組和治療組比較P0.05. 胞膜：燒傷可以使胞膜PKC的活性上升，P0.05. 而經PD治療后PKC的活性有所恢復，與燒傷組相比較P0.05. 而治療對照組的PKC活性與治療組相比較P0.05，與燒傷組比較P>0.05(表1).2.2PD對LPS刺激下SMC胞質及胞膜PKC活性的影響胞質：LPS刺激后細胞胞質PKC的活性升高，與正常組相比P

17、0.05. 經PD治療后PKC活性有下降，與LPS刺激組相比P0.05，而治療對照組PKC活性沒有恢復. 胞膜：SMC胞膜PKC的活性也上升，與正常組相比P0.05. 經PD治療后PKC的活性有所下降，與LPS刺激組相比P0.05. 不同的是治療對照組的PKC活性下降更明顯，與治療組和正常組相比P值均0.01(表1).表1虎杖苷(PD)對燒傷血清及脂多糖（LPS）刺激下大鼠平滑肌細胞(SMC)蛋白激酶C活性的影響3討論本實驗中，燒傷血清刺激VSMC 2 h后, 胞質的PKC活性下降，胞膜PKC的活性上升，表明燒傷血清的作用主要是促進PKC的激活轉位. 而PD處理則減低了胞膜PKC的活性，升高了

18、胞質中PKC活性. 表明PD可對抗燒傷血清引起的PKC異常變化. 實驗中我們還發現治療對照組的胞質PKC活性升高很多. 其原因可能為，治療對照組是在燒傷血清的基礎上加DHanks液，并沒有去除燒傷血清，使燒傷血清的刺激作用長期存在，導致大量脂質氧化物質的產生，這些物質可以顯著減慢DAG的降解2,5，從而持續不斷的激活PKC，使胞質中PKC的活性持續升高，提示PD對燒傷治療的機制可能與其調節PKC的活性有關. 它通過維持PKC活性的穩定來減輕機體的損傷.在感染性休克發生過程中，LPS是主要的致病因素. 從本實驗結果來看，LPS刺激VSMC后，細胞胞質和胞膜的PKC活性均升高，表明LPS引起的損傷

19、效應至少有部分是通過PKC信號系統介導的. 其激活PKC的機制可能有以下幾方面6：LPS能直接引起肌醇磷脂分解產生DAG，從而激活PKC；同時LPS與十四佛波乙酸酯相似，有可能以佛波酯類物質的方式直接激活PKC；此外，它還可以使機體釋放大量血管緊張素、兒茶酚胺等因子，這些因子也能引起細胞膜肌醇磷脂分解產生DAG，進一步激活PKC.LPS損傷的VSMC給予0.4 mmol/L PD作用后，細胞質和細胞膜PKC的活性均減低. 提示PD可能是通過影響PKC的活性來對抗LPS的損害作用，但是PD是通過什么機制調節PKC的活性還不太清楚. 對于治療對照組，其胞質的PKC活性與LPS組相比沒有太大變化，而

20、胞膜的PKC活性降低較顯著，這可能是由于PKC的耗竭機制和自我反饋機制而導致. 由于LPS的刺激在對照組并沒有去除，其持續刺激一方面導致PKC的大量消耗，到后期沒有足夠的PKC從胞質轉位到胞膜上，另外一個方面可能是由于PKC活性的升高反饋性的抑制了胞膜PKC的活性，從而降低了胞膜PKC的活性5.但是與燒傷損傷不同的是，LPS激活后的PKC并沒有使平滑肌的收縮性增強，反而使其收縮性下降5. 這可能是由于LPS激活的PKC同工酶與其它損傷所激活的同工酶不同，進而導致其作用底物不同而致. PKC的同工酶不少于12種，其中cPKC包括PKC,和，而nPKC則包括PKC，和. 在LPS刺激SMC時，主要

21、是PKC，和被激活. PKC的磷酸化使誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活化，iNOS的增加導致了NO的大量合成，NO為強烈的舒血管因子，可以使血管強烈擴張. 由于LPS持續的刺激，PKC被持續激活，iNOS也就大量產生，使NO在胞內的含量增加，從而導致了SMC收縮性的下降.【參考文獻】1 黃巧冰，趙克森，黃緒亮. 虎杖4號與多巴胺、6542治療大鼠失血性休克療效的比較J. 微循環學雜志， 1995, (1): 7-9.2 Begum N, Duddy N, Sandu O, et al. Regulation of myosinbound protein phosphatase by insulin in vascular smoo