1、測序常見問題及其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From: HTUTU1、PCR產物測序時出現重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導致測序結果移碼）圖1-1圖1-2解決方法：將PCR產物克隆到質粒（如T載體）中挑單克隆測序，或將PCR產物進行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進行測序。問題圖2（PCR產物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）圖2解決方法：主要原因是PCR產物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產物進行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠

2、純化）后再進行測序，便可解決。問題圖3（測序引物有堿基缺失）測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或將引物進行PAGE純化2、克隆測序時出現峰形重疊原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測序用質粒中含有兩種以上插入片段不同的質粒；或是是送測序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質粒或送菌液再次測序。3、樣品有雜合/突變位點模板中有雜合型突變，也就說模板

3、本身在這個位點出現突變；或者是從基因組中擴增出來的雜合位點。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重疊峰(如圖中箭頭所示)。解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測序。4、poly A/T和C/G cluster導致的套峰和測序信號衰減圖4-1圖4-3圖4-4RACE測序時經常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；但如果這樣的序列出現在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。C/Gcluster在PrV基因組測序時遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時候卻不得不用它們的產

4、品和服務。5、基因中含有重復序列可能的原因:樣品中含有重復序列導致的測序結果和PolyA/T的結果一樣，會導致Frame滑動，較短的重復序列會導致測序結果出現移碼；而較長的重復序列會使定序信號衰減。解決辦法:反向測序有時能夠順利的通過重復序列區域(但不是一定都能夠)，通過多次的測序結果比對，拼接可以得到全序列結果。TT測序結果常見的幾個問題TT(From: HTUTU )1 、 為什么開始一段序列的信號很雜亂，幾乎難以辨別?這主要是因為殘存的染料單體造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測序電泳開始階段電壓有一個穩定期，所以經常有20-50 bp 的緊接著引物的片段讀不清楚，

5、有時甚至更長。 2 、 為什么在序列的末端容易產生 N 值，峰圖較雜?由于測序反應的信號是逐漸減弱的，所以序列末端的信號會很弱，峰圖自然就會雜亂，加上測序膠的分辨率問題，如果堿基分不開，就會產生 N 值，正常情況下ABI377測序儀能正確讀出500個堿基的有效序列。 3 、 測序結果怎么找不到我的引物序列?如果找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因為引物本身是不被標記的，所以在測序報告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴增引物，可能是您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時需找引物的互補序列。

6、 4 、 測序結果怎么看不到我克隆的酶切位點?可能的原因同上，您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點。通常我們會盡量選擇距離酶切位點遠點的引物，當然，若是樣品出現意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點也是看不到的。 5 、 你測出的結果與我預想的不一致，給我的結果與我需要的序列有差距，這是怎么回事?首先，我們會核實給您的測序結果是否對應您的樣品編號，如果對應的是您的樣品，由于不知您的實驗背景，測得的序列是否與您預想的結果一致我們無法判斷，我們能做到的是檢查發送給您的測序結果和您提供來的樣品是否一致。 6 、 序列圖為什么會有背景

7、噪音(雜帶)?是否會影響測序結果?序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強會影響測序結果，要看信噪比，我們給的結果信噪比大都在98%以上。 7 、測序 結果為什么與標準序列有差別？原因可能有： 樣品個體之間的差別、測序準確率的問題，自動測序儀分析序列的準確并非100%，建議至少測一次雙向，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。當然盡管我們有時做了最大努力，但還是保證不了和文獻序列完全一致，但我們測序報告是客戶樣品序列的真實結果。 8 、 PCR 產物測序與克隆后測序序列為什么有差別?PCR 產物克隆到載體中進行測序，有兩個方面可能序列有變化：首先， PCR 擴增過程中可能產生錯配。將片段克

8、隆到載體中也有可能發生突變；其次，測序的準確率并非100%。 9 、 有雜合位點，但你們的報告上看不到雜合的信號！如果在您認為應該出現雜合信號的位置上只出現單一的信號，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒達到可以測出的濃度。測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會自動將它作為背景信號了，很難檢測出來。只有當測序反應體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時，也不一定能準確檢測到突變的存在，因為，測序儀是主要用來測序正常的堿基序列的，軟件分

9、析結果時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結果。尊重結果，我們是不會人為將出現單一的信號修改為雜合位點的。 10 、 DNA 測序樣品用 TE 溶液溶解好不好?由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測序反應也是 Taq 酶的聚合反應，需要一個最佳的酶反應條件,因此 DNA 測序樣品溶解時，最好用滅菌水溶解。 11 、 我送什么形式的菌體樣品好?菌體的一般形態有、菌液，平板培養菌、穿刺培養菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態以方便且不易受污染為準則，推薦穿刺培養菌。 上海客戶用過夜培養好的菌液2 ml 。 12 、 為什么你們給我的序列是反的?

10、測出來的結果與您預期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產物 T/A 克隆中較常見。有時，客戶要求的測序引物離克隆位點較近，如果反向引物相對克隆位點較遠，為得到更好的結果，我們會選擇反向引物測序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉過來，就可得到正向序列。 13 、 Template mixed 為何種情況?測序結果表現為套峰，測序反應信號很好，測序結果雜亂,即同一個位置有二個峰。原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產物中有雜帶、質粒為雙克隆產物、引物特異性不高，有兩個結合點， PCR 產物電泳時看不出，但測序結果能清楚地說明這點。 14 、 po

11、lyT 或 polyA 后峰圖雜，怎么也要收費?這種情況一般表現為 A 、 T 連續結構后面的測序結果出現套峰，是樣品的內在原因。這類問題我們應該同正常測序一樣，給客戶報告，反應按正常收費。 15 、 我的引物做 PCR 條帶很好，但為什么測不出序來？并不是能做 PCR 反應的引物都能測序，測序所用引物要求較高,必須與模板完全匹配（有時 5' 端可以有個別堿基的簡并），引物長度一般為20個堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測序的引物一定要足夠純。 16 、如果 我的菌種培養得很好，測序應該不會有問題吧?對于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 ， DH1 、 和 C600 E.coli 菌

12、株也可， XL1-Blue E.coli 菌株也不錯，但其生長過慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產生大量的碳水化合物（即糖），而應當盡量避免使用；其它宿主菌可能會對測序造成影響。 17 、 為什么 G/C rich 的樣品沒結果或結果不好，照常收費?由于 G/C 連續結構有時會造成反應中途無法正常進行，如果結構在引物下游近處，反應只有一小段的信號，有時甚至反應根本沒信號。對于這種情況，本身就潛在不確定性的測序，有很大的失敗因素。 18 、 PCR 產物150 bp 以下的為什么不適于直接測序?PCR 產物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難，

13、用于測序的 PCR 產物一般不低于150 bp 長度。一個150 bp 的 PCR 產物用于測序，去掉兩個引物的序列大約40到50 bp ， 再加上測序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過幾十堿基。這只是最理想的假設，這么短片斷測序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進行測序。 19 、 我的質粒樣品很好，測序結果怎不好?由于原因不明的復雜結構如發卡和回文結構，有時會出現突然信號減弱或消失；有時測序根本不能進行下去， DNA 堿基排列并無特別異常，可能是 DNA 整體出現復雜結構，反應無法進行。 20 、 我的樣品還保留了嗎?我想現在反向再測一個反應。出于保密原則我們測序樣品只保

14、留一個月，所以若要再測序，請抓緊時間，否則只有重新送樣。 21 、 已經測通了樣品，但重疊的地方有錯配，是為什么?測通的全序列是拼接后的結果，由于拼接處一般是在一次測序的末端和次個反應開始一段，通常會有一定的雜帶，以序列信號好的為主，次的為參考，但也不絕對。 常見峰圖及原因說明(From: HTUTU )1.PCR產物電泳檢測條帶單一，為什么測序結果說模板雜？2. 什么是堿基缺失？3. 什么是引物不純？4. 重復結構對測序有哪些影響？5. 什么是模板不單一？6. Poly結構的測序結果是怎樣的？7. 含有回文結構的模板測序結果是怎樣的？8. 測序峰圖為前雙峰的結果是什么樣的？9. 測序峰圖為后

15、雙峰是什么樣的？10. 無信號的結果：信號值(ATGC的平均值)皆小于10011. 飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時堿基產生替代而出現堿基位移12. 沒有任何干擾的結果Q-1.PCR產物電泳檢測條帶單一，為什么測序結果說模板雜？A-1.PCR產物電泳檢測的結果只是一個粗略的定性結果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴增產物是無法用肉眼區分開的。但是DNA測序反應敏感而客觀，可以直接反應出模板本身的情況。需要強調的是，高質量的PCR產物才可能得到高質量的測序結果，如果您對PCR產物的純度不很確定，希望您可以將PCR產物進行克隆處理，以確保得到好的測序結果。以下圖為例：該反應

16、的背景信號較高，不利于堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴增。或者可以將該PCR產物克隆到質粒中，初步篩選后進行單克隆測序。 Q-2.什么是堿基缺失？A-2.以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產物中，特別是從基因組中擴增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個連續的T解決方法： (1) 使用反向引物繼續測序，以矯正缺失位點并達到測通的目的。或者將該PCR產物克隆到質粒中，挑取單克隆測序。 (2) 如果可以確定該PCR片段中不應該有缺失的位點，那么可以改變PCR反應條件，重新擴增。 Q-3.什么是引物不純？A-3.以下圖為例：引物不純造成移碼現象，該種現象與模板雜在峰圖都表現為背景峰較雜，

17、但是引物不純在峰圖上表現的更有規律，一般在每一個主峰前或者后都有一個同一堿基的小峰。解決辦法：重新合成引物，或者將引物進行PAGE純化后再進行測序。 Q-4.重復結構對測序有哪些影響？A-4.以下圖為例：重復結構將導致測序復制框的滑移，重復結構之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該重復結構處，即可完成模板全長的拼接。 Q-5.什么是模板不單一？A-5.以下圖為例：(1) 菌液為非單克隆： 下圖是pGEM-T載體測序的結果，在83位點處測序結果出現雙峰（插入后雙峰），即模板中含有兩個或兩個以上的相同載體，但是插入片段不同。 解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質粒。需要注意的

18、是，重新進行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。(2) PCR產物不純，如下圖所示：在197bp前測序峰表現為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，這個A峰標志著此PCR產物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。 注：PCR產物測序都是以A高峰終止。 解決方法：對PCR產物切膠純化，再進行測序。 Q-6.Poly結構的測序結果是怎樣的？A-6.以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結構之后往往出現移碼、雙峰、套峰現象，而在polyG/C之后會往往導致測序信號的衰減或者直接中斷。 解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該poly

19、結構處，即可完成模板全長的拼接。如果是較長的PloyG/C，建議客戶使用3.0試劑盒進行測序。 Q-7.含有回文結構的模板測序結果是怎樣的？A-7.以下圖為例：位點94至137是一個回文結構，該結構導致后面的信號衰減，出現錯誤的判讀。 解決方法：使用反向引物對模板進行測序，測到該回文結構處，即可完成模板全長的拼接。 A-8.測序峰圖為前雙峰的結果是什么樣的？A-8. (1) 產物中含有小片段PCR產物；(2) 引物有兩個結合位點，其中一個結果中斷解決方法：換引物反向測序。 Q-9.測序峰圖為后雙峰是什么樣的？A-9.原因和解決方法同回文結構及插入后雙峰。Q-10.無信號的結果：信號值（ATGC

20、的平均值）皆小于100A-10.以下圖為例：測序無信號的判定： 在確認引物、質粒抽提濃度、反應安排等條件無問題的情況下，測序結果峰型雜亂且信號值小于100的結果；此時則判定結果為測序無信號。兩次測序無信號，我們會取消實驗。 Q-11.飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時堿基產生替代而出現堿基位移A-11.以下圖為例在用特殊試劑盒（3.0）時，會發生堿基替代，從而出現堿基位移的現象，即飄峰。 解決方法：用普通試劑盒（3.1）測序消除堿基位移。 注：3.0試劑盒只對局部高GC有效，對POlyA/T、重復結構（GT/GA等）無效，建議先用3.0試劑盒測序，然后用普通試劑盒進行糾正。 Q-12.沒有任何

21、干擾的結果A-12.DNA 測序常見問題解答（FAQs）(From : HTUTU )DNA 測序常見問題解答（FAQs）Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準確度如何？Q2. 為什么在測序報告上找不到我的引物序列？ Q3. 我有一個大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。 Q4. 為什么我的PCR片段為300bp，而你們發送給我的序列卻達到了700多bp？ Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結果？ Q6. 我進行PCR反應時，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度對我的樣品完成測序反應？ Q7. 我的PCR擴增產物有多條帶，

22、是否可以為我完成切膠純化，再進行測序反應？哪些情況下需要進行切膠純化？ Q8. 我的PCR產物為單一條帶，但未經純化，是否可以直接送到貴公司進行測序？ Q9. 我的PCR產物電泳檢測條帶單一，為什么測序結果說模板雜？ Q10. 什么是堿基缺失？ Q11. 什么是引物不純？ Q12. 重復結構對測序有哪些影響？ Q13. 什么是模板不單一？ Q14. poly結構的測序結果是怎樣的？ Q15. 含有回文結構的模板測序結果是怎樣的？Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準確度如何？答：DNA測序的原理是末端終止法。具體步驟如下：  

23、0;     定量：對樣品及引物進行定量。        測序反應：在反應體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應。        讀取數據：利用測序儀讀取被測樣品的堿基序列。        ABI公司目前承諾測序結果在800bp以內準確率為98.5%。Q2. 為什么在測序報告上找不到我

24、的引物序列？答：1） 如果您提供的是PCR樣品，在測序報告上找不到您的引物序列是正常的。這是因為測序反應是通過對被熒光標記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒 有熒光標記，因此自然在測序結果中就不會被識別。實際上不但測序引物無法識別，而且由于目前測序技術的局限性，緊靠測序引物一側的3050個bp通常也無法100識別，如果需要驗證這個區域的堿基序列或者測序引物本身的序列，就需要用另一側引物進行反向測序。2 ）您提供的是質粒或菌液樣品,使用通用引物測序，找不到您的PCR引物可能是因為您的PCR引物距離載體的通用引物位點過近，由于測序反應在距離起始位點30-50bp內的結果可信度不高

25、，因此會影響您正確讀取您的PCR引物序列。Q3.我有一個大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。答：對于片段較大的PCR樣品我們建議您將其克隆進載體后再做測序。因為，一方面PCR產物的純度不是很好掌握，測序的成功率不如質粒和菌液測序；另一方面，與PCR引物相比，一般載體上的通用引物與模板結合的能力更強。長度為1Kb的DNA模板需要兩個測序反應，才有可能得到完整準確的讀長，對于1kb以上的DNA片斷，在兩個反應后還需要設計合成測序引物，測序后拼接出全長，對于這些測序引物，我們將按堿基個數收取引物合成費用。Q4.為什么我的PCR片段為300bp，而你們發送給我的序列卻達到了700多bp？答：如果

26、您查看峰圖的話，可以在您的PCR序列終止處看到一個高高的A峰，該A峰是您的PCR測序反應的結束標志，在此標志之后的序列是噪音，而不是您的測序結果。因為我公司完全忠實于測序結果，不會對測序結果進行人為修改。所以在您收到結果時，請結合我們的DNA測序服務報告查看測序峰圖，按照您的實驗要求對測序結果進行分析。Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結果？答：用于測序的引物比用作PCR反應的引物要求高，以下是不適合用于測序反應的引物類型：        不純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會直接

27、造成嚴重的背景峰。用于測序的引物序列長度之所以一般在24個堿基之內，就是因為過長的引物純度不易保證。        簡并引物，隨機引物和有特殊標記的引物都不適合DNA測序。Q6. 我進行PCR反應時，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度對我的樣品完成測序反應？答：非常抱歉，目前我公司不會單獨對客戶的測序反應設定特定的條件，全部的測序反應均在統一的條件下完成。Q7. 我的PCR擴增產物有多條帶，是否可以為我完成切膠純化，再進行測序反應？哪些情況下需要進行切膠純化。答：目前我公司通常只接收單一條帶的PCR產物，一般不提供切膠純

28、化服務。如果老師自己實驗室的確無法完成切膠工作，在同意交付25元/條帶的服務費后，我公司可以提供此項服務。PCR產物電泳檢測后發現以下情況之一時，建議進行切膠純化：1） 除主帶外，還存在其他條帶；2） 引物二聚體在過柱純化后還大量存在，將影響測序結果；3）體系中鹽分在過柱純化后還影響測序結果。Q8. 我的PCR產物為單一條帶，但未經純化，是否可以直接送到貴公司進行測序？答：可以。我公司將免費為您進行PCR產物的過柱純化，目的在于去除PCR反應體系中的大部分小片段、剩余dNTP及大部分的鹽分。Q9. 我的PCR產物電泳檢測條帶單一，為什么測序結果說模板雜？答：PCR產物電泳檢測的結果只是一個粗略

29、的定性結果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴增產物是無法用肉眼區分開的。但是DNA測序反應敏感而客觀，可以直接反應出模板本身的情況。需要強調的是，高質量的PCR產物才可能得到高質量的測序結果，如果您對PCR產物的純度不很確定，希望您可以將PCR產物進行克隆處理，以確保得到好的測序結果。以下圖為例：該反應的背景信號較高，不利于堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴增。或者可以將該PCR產物克隆到質粒中，初步篩選后進行單克隆測序。Q10.什么是堿基缺失？答：以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產物中，特別是從基因組中擴增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個連續的T。解決

30、方法：1) 使用反向引物繼續測序，以矯正缺失位點并達到測通的目的。或者將該PCR產物克隆到質粒中，挑取單克隆測序；2) 如果可以確定該PCR片段中不應該有缺失的位點，那么可以改變PCR反應條件，重新擴增。Q11.什么是引物不純？答：以下圖為例：引物不純造成移碼現象，該種現象與模板雜在峰圖都表現為背景峰較雜，但是引物不純在峰圖上表現的更有規律，一般在每一個主峰前或者后都有一個同一堿基的小峰。解決方法：重新合成引物，或者將引物進行PAGE純化后再進行測序。Q12.重復結構對測序有哪些影響？答：以下圖為例：重復結構將導致測序復制框的滑移，重復結構之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測

31、到該重復結構處，即可完成模板全長的拼接。Q13.什么是模板不單一？答：以下圖為例，下圖是pGEM-T載體測序的結果，在83位點處測序結果出現雙峰，即模板中含有兩個或兩個以上的相同載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質粒。需要注意的是，重新進行PCR反應或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。對于PCR產物也同樣有模板不單一的情況，如下圖所示：在197bp前測序峰表現為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，這個A峰標志著此PCR產物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。解決方法：對PCR產物切膠純化，再進行測序。Q14. poly

32、結構的測序結果是怎樣的？答：以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結構之后往往出現移碼現象，而在polyG/C之后會往往導致測序信號的衰減。解決辦法：使用反向引物對模板進行測序，測到該poly結構處，即可完成模板全長的拼接。Q15.含有回文結構的模板測序結果是怎樣的？答：以下圖為例：位點94至137是一個回文結構，該結構導致后面的信號衰減，出現錯誤的判讀。解決方法：使用反向引物對模板進行測序，測到該回文結構處，即可完成模板全長的拼接。手把手教您看測序圖(From: HTUTU )一般來說，我們只需把測序序列結果和原有的目的序列結果進行比對（Blast）就行了，如果序列百分之百吻合，或者

33、所需要的突變點（片段）成功突變或插入片段成功插入，就OVER了。關鍵是測序結果有時候模憐兩可，需要我們自己來把握，或者說，為我們自己爭取不付費的權利。測序看圖文件有吧？沒有就下載這個：點擊瀏覽該文件里面有個補丁，打一下，就可以永久使用了。測序結果文件一般有兩個，一個是序列文件，一個是圖譜文件，圖譜文件用上面的程序可以打開（*.abi.或 *.scf)。序列文件打不開？那您能隨便裝個什么DNAstar,DNAman或者俺最喜歡用的Genetool，或者裝個edit（這玩意好啊，一般人沒用過，呵呵）1.安裝好看圖軟件后，雙擊峰圖文件就可以打開，沒有序列文件？那下一個吧：點擊瀏覽該文件 打開峰圖文件

34、，依據圖形初步判定測序質量，這個圖一般般，頭峰雜度比較大，至少前50bp序列不可信。2. 既然峰形不錯由此初步判定測序結果可信，那就來比比測序結果與我們預期的有什么差異吧. 當我們打開圖形文件的時候，我們也可以輸出測出來的序列，就是export啦，如下圖，port后能得到文本形式的序列結果不過俺一般習慣了用ultra-edit，直接雙擊測序公司提供的序列文件，它是這樣顯示的：我說，您還是別用了，俺當初是用ultra-edit處理一些其它數據（當然是word/notebook等無法勝任的數據）時，發現它還可以打開*.seq文件，于是就一直用過來了3.關于序列比對，沒有太多好說的吧。假設原有序列為

35、A文件，測序結果為B文件，例如，在DNA工具軟件genetool中打開B，通過調用工具（上圖），進入Blast程序(說這個是Blast程序有點牽強，其實是同源性比較，其實質不就是Blast的嘛，哈哈)。加上原序列文件A之后，就直接按align all button啦這個就是比對結果：4、峰圖頭尾測序結果的不可靠性：頭尾的問題，很多測序公司都明確標出了頭尾各80-100bp序列的不可靠性，這是測序起始信號與終止信號不穩定的體現，就如同一個跑步一樣，發力起跑與力衰止跑之時，速度是不穩定的，無法用來衡量其跑步速度.但俺見識過一家測序公司的測序結果，既使是頭尾區，其結果也是可信的，但總體測序長度不夠長

36、，可能是用其它軟件進行了掐頭去尾之后移花接木的處理吧！這里要強調一點的是，有時候測序公司給出的是反向測序結果，簡單的align得不到匹配結果，這時，你千萬不要急著罵測序公司，試試把測序結果reverse 或reverse complement一下再進行align，也許會有預期的結果(見過不少這樣的朋友，其實仍然只能怪我們自己_)5.干擾峰與結果判讀這個峰是作出來的，線條有點粗，將就說事。第一個峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點可能存在SNP現象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認定樣品此處堿基為T為行了。第二個峰，錯位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預期多一個堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們仍只需認定樣品此處堿基為T為行了。所謂干擾，前提前件是主峰要清晰、連續，但峰圖中莫名其妙多出一條類似或接近于主峰清晰程度的峰線，但這種峰線往往是不平滑、不連續的，這是干擾峰判讀的重點！6、SNP的判讀做SNP的人不少，AFLP仍然是一種經濟、適用的方法之一。AFLP的結果多需要用測序來進行驗證，但似乎以測序來驗證結果的人并不多，或者說驗證一二個樣本就完了，其實這樣并不科學，還是多驗證幾個吧，證據多