1、5AL-FENGHAI-(2020YEAR-YICADJINGBIANThe rmo-Sc i ent i f i c-GeneJET-Ge I-Extract i on-mat i oni nfi t (k069)-product-保存和穩(wěn)定性:試劑盒要保存在室溫下（15-25度）。建議將純化柱保存在4度，可儲存多于一年。 任何在保存過程中產(chǎn)生的沉淀都可以在37度恒溫中溶解，然后在使用之前冷卻至室溫。 注意：每次用后用純化柱后都要關(guān)緊袋子。GeneJET Gel Extraction Kit50 preps #K0691250 preps #K0692Binding Buffer30 mL1

2、50 mLWash Bufferfconcentrated)9mL45 mLElution Buffer(10mMTris-HCIzpH 8.5)15 mL30 mLGeneJET Purification Columns (preassembled with collect:ion tubes)50250說明書The GeneJET? Gel Extraction Kit,設(shè)計的U的是從在TAE或者TBE緩沖液里電泳的標準 或者低熔點的瓊脂糖凝膠中，高效快速回收純化DNA片段。這個試劑盒以便利的旋轉(zhuǎn)層 析柱的基礎(chǔ)上，應(yīng)用了基于二氧化硅薄膜的專利技術(shù)。試劑盒可以用于純化20-25bp大小 的D

3、NA片段。在lOObp - lOkb DNA片段大小范圍內(nèi)，回收率提高到95%。每個GeneJET 純化柱可純化高達25kg DNA,可用高達2克的瓊脂糖凝膠。整個過程只用15分鐘，分離的DNA片段將用于普遍的下游應(yīng)用，包括連接反應(yīng)，限 制性設(shè)計，PCR,測序和分子標記。原理：目的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分割，將其置于微型離心管中，用Binding Buffer 溶解后上柱，Binding Buffer中的促洛劑可以洛解瓊脂糖，變性蛋口質(zhì)，促進DNA結(jié)合到 層析柱的硅膜上。另一點方便的是，Binding Buffer中含有顏色指示劑，可以檢測DNA結(jié) 合最好時的溶液PH,雜質(zhì)經(jīng)過簡單的清洗

4、步驟就可以去除。純化的DNA用Elution Buffer 從層析柱中洗脫出來，回收的DNA可用于下游應(yīng)用。重要的注意事項：1、在最開始使用試劑盒前，用96-100%的乙醇稀釋Wash Buffero50 preps#K0691250 preps #K0692WashBuffer (concentrated)9 mL45 mLEthanol45 mL225 mLTotal Volume54 rr)L270 mL2、加入乙醇后，在盒子的復(fù)選框中標記，以注明完成的步驟。3、每次用之前，檢驗Binding Buffer是否生成沉淀。假如有沉淀，將溶液置于37度使其 溶解，然后冷卻至25度。4、用Bi

5、nding Buffer時要帶手套，因為里面含有刺激性物質(zhì)。5、當提取的DNA直接用于測序時，不能使用重復(fù)利用的電泳緩沖液。外的材料和需要的設(shè)備:96-100% 乙醇 異丙醇3 M醋酸鈉,PH5.2 （可能不用）微型離心機15或2亳升微型離心管加熱器或水浴鍋開始前多注意事項：1、開始操作前閱讀注意事項。2、所有純化步驟在室溫下操作。3、所有的離心條件都要保證在桌面微型離心機中的轉(zhuǎn)速大于12000go操作步驟：步驟1：用解剖刀或剃刀片切割含有DNA片段的凝膠，盡可能的靠近DNA片段切 割，以減小凝膠的含量，將膠片放在事先稱重的15毫升離心管并稱重。記錄膠片的重 量。注意如果純化的DNA片段用于克

6、隆反應(yīng)，要避免暴露在紫外燈下對DNA的損害。減 少紫外線照射時間到兒秒鐘，或在紫外照射期間保持膠片在玻璃或塑料盤中。步驟2：加1:1量的Binding Buffer到膠片中（量以重量計,如每100毫克瓊脂糖凝膠 加 100 微升的 Binding Buffer）注意：對于瓊脂糖含量大于2%的凝膠，要用2： 1的比例加Binding Buffer到凝膠片 中。步驟3：在50-60度的條件下溫育凝膠混合物10 min,或者等到凝膠全部融化。每隔 兒分鐘將試管顛倒混勻一次，促進膠融化，保證膠全部溶解。在上柱前將凝膠混合物快速 渦旋混勻一次。檢查溶液的顏色，黃色是結(jié)合DNA的最佳PH。如果顏色是橙色或

7、紫色，要加10RLpH 5.2的3 M S3酸鈉溶液，混勻，溶液會變?yōu)辄S色。步驟4：（500bp-10kb的片段才有此步）如果該DNA片段為S500 bp,以1:2的體積比例將100%異丙醇加至已溶解的凝膠溶液（如100H異丙醇應(yīng)該被添加到溶解100毫克 凝膠片的lOOpLBinding Buffer中）。徹底混勻。如果該DNA片段是10 kb的,以1:2的體 積比例將水加入到已溶解的凝膠溶液（如100J1L水應(yīng)該被添加到溶解100毫克凝膠片的 lOOjiLBinding Buffer 中）。徹底混勻。步驟5：轉(zhuǎn)移最多800nL凝膠溶解液到基因回收純化柱。離心1分鐘。棄去流出液， 然后將柱放回

8、相同的收集管。注意：如果總量超過800nL,溶液可以分兒次加入。每次操作后離心30-60 s并丟棄 流出液，重復(fù)操作，直到所有溶解液都加到離心柱膜上，但是每個柱不能超過1克瓊脂 糖。每次使用后蓋緊裝有純化柱的袋子！步驟6：可選步驟。當純化的DNA將被用作測序時，才有此次結(jié)合步驟。加 lOOuLBinding Buffer到GeneJET純化柱。離心1分鐘。棄流出液,然后將柱放回相同收集 管。步驟7：加入700nLWash Buffer （已用乙醇稀釋）到GeneJET純化柱。離心1分鐘。 棄去流出液，然后將柱放回相同的收集管。步驟&離心空GeneJET純化柱1分鐘，徹底去除殘留的Was

9、h Buffer。注意：這一步是必要的，以避免在純化的DNA溶液中殘留乙醇。殘留乙醇的存在可 能抑制下游酶促反應(yīng)。步驟9：將GeneJET純化柱轉(zhuǎn)移到一個干凈的1.5 ml離心管,力口 50piLEIution Buffer于 純化柱膜。離心1分鐘。注意：（1）對于DNA含量低的，洗脫體積可減小以增加DNA濃度。（2） 20-50L 之間的洗脫液體積不顯著減少DNA產(chǎn)量。但是洗脫體積應(yīng)不小于lOnLo （3）如果DNA 片段10 kb,使用到柱上前先將Elution Buffer預(yù)熱至65°Co（4）如果洗脫體積為10L并且DNA含量S5微克，離心前室溫下孵化離心柱1分鐘。步驟10

10、:丟掉GeneJET純化柱并儲存純化的DNA在-20°Co問題分析：1、DNA產(chǎn)量低的原因和解決方法：（1）凝膠片不完全溶解。確認以1:1的體積將Binding Buffer添加到稱好的凝膠片 （例如每100毫克瓊脂糖凝膠,加100 nL的Binding Buffer）。確保凝膠切片加到GeneJET純化柱之前完全溶解。大量瓊脂糖或凝膠切片用瓊脂糖白分比大2%,可能需要額外的時 間以使其溶解。在某些情況下，較大體積的Binding Buffer和凝膠溶液的額外的渦流混 勻，可以促進溶解。（2）低效的DNA結(jié)合。凝膠片完全洛解后檢查溶液的顏色。黃色顏色表示DNA結(jié)合 的最佳pH值。如果

11、溶液的顏色是橙色或紫色，加10kLpH 5.2的3 M酷酸鈉溶液，混勻。 混合的顏色會變黃色。（3）低效的膜清洗。確保首次使用前，濃縮的Wash Buffer已經(jīng)用乙醇稀釋。（4）低效的DNA洗脫。直接將Elution Buffer添加到膜的中心，而不是到GeneJET純 化柱的側(cè)面。用20-50nL Elution Buffer,確保該體積完全覆蓋膜表面。在純化含量較大的 DNA片段時（15ng）,可將Elution Buffer的體積增加至兩倍或執(zhí)行兩次洗脫循環(huán)。在步 驟8中，確保所有殘留的Wash Buffer從膜中除去，長時間離心有助于去除Wash Buffer。2. DNA在瓊脂糖凝

12、膠中保存不好的原因及解決方法：存在殘留乙醇。在步驟8中，確保所有殘留的Wash Buffer從膜中除去，長時間離心 有助于去除Wash Buffero3. 低質(zhì)量的測序結(jié)果的原因及分析：重復(fù)利用電泳緩沖液引起的污染。如果提取的DNA將被直接用于測序，應(yīng)該用新配 制的電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠和進行電泳。4、下游應(yīng)用不成功的原因及分析：（1）殘留的乙醇的存在。在步驟8中，確保所有殘留的Wash Buffer從膜中除去，長 時間離心有助于去除Wash Buffero（2）低效的膜清洗。如果收集管在洗滌步驟過程中裝的過多，部分Wash Buffer可能 殘存在GeneJET純化柱的底部。每次離心后將流出液丟棄，以避免此種情況。（3）瓊脂糖洗脫液污染。確保凝膠切片按照步驟正常溶解。確認以1:1的體積將 Binding Buffer添加到精確稱好的凝膠切片中。大量瓊脂糖與瓊脂糖凝膠的百分比大于 2%,可能需要更多的時間來溶解。通常情況下，加入大量的Binding Buffer或?qū)⒛z溶液 頻繁的渦旋混勻數(shù)次，可以促進溶解。（4）洗脫液沾染過多的鹽。確保在步驟7中的清洗是高效的。在離心之前，用Wash Buffer孵育GeneJET純化柱兒分鐘。安全信息：Binding Buffer中