1、精品文檔專題二課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數【基礎知識】一、理論基礎1 .篩選菌株(1) 實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于 生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時 或 其他微生物生長。(2)選擇培養基：在微生物學中，將允許 種類的微生物生長，同時 和 其他種類微生物生長的培養基，稱作選擇培養基。(3)配制選擇培養基的依據根據選擇培養的菌種的生理代謝特點加入某種物質以達到選擇的目的。例如，培養基中不加入有機物可以選擇培養 微生物；培養基中不加入氮元素，可以選擇培養 ;的微生物.加入高濃度的食鹽可選擇培養金黃色葡萄球菌等。2 .統計菌落數目(1)測定微生物數量的常用方法有 和

2、。(2)稀釋涂布平板法統計樣品中活菌的數目的原理當樣品的 足夠高時，培養基表面生長的一個菌落， 來源于樣品稀釋液中的一個 c 通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結果準確，一般選擇菌落數在 的平板進行計數。此外，測定微生物數量的常用方法還有 直接計數。3 .設置對照設置對照的主要目的是排除實驗組中 對實驗結果的影響，提高實驗結果的 C 例如為了排除培養基是否被雜菌污染了，需以培養 的培養基作為空白對照。二、實驗設計關于土壤中某樣品細菌的分離與計數實驗操作步驟如下：1 . 取樣：從肥沃、濕潤的土壤中取樣。應先3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的 中。2 .制備

3、 :準備牛肉膏蛋白月東培養基和選擇培養基，將菌液稀釋相同的倍數，在 牛肉膏蛋白陳培養基上生長的菌落數目應明顯 選擇培養基上的數目，因此，牛肉膏蛋白月東培養基可 以作為,用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用。3 .微生物的 與觀察將10g 土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中(體積為250 mL),充分搖勻，吸取上清液 , 轉移至盛有 的生理鹽水的無菌大試管中，將土樣以 1、101、102 依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107103稀釋度的順序分別吸取 進行平板涂布操作。每個稀釋度下需要 3個選擇培養基、 1個牛肉膏蛋白月東培養基。 將涂布好的培養皿放在 30 c溫度下培養，及時觀

4、察和記錄。 挑選選擇培養基中不 同形態的菌落接入含 培養基的斜面中，觀察能否產生如教材中圖 2-10的顏色反應。4 .細菌的計數當菌落數目穩定時，選取菌落數在 的平板進行計數。在同一稀釋度下，至少對 3個平 板進行重復計數，然后求出 ,并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。三：思考與討論(1)如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數？(2)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的 細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？(3)P183在該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？(4) P183這種培養基對微生物是否具有

5、選擇作用？如果有，又是如何進行選擇的？(5) P183你認為哪位同學的結果接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？(6) P183你能通過設置對照，幫助 A同學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？專題2課題3分解纖維素的微生物的分離基礎知識一、纖維素與纖維素酶1 .纖維素的化學組成： 三種元素，是一種 糖。2 .纖維素的分布： 是自然界中纖維素含量最高的天然產物，此外，木材、作物秸稈等 也富含纖維素。3 .纖維素酶的作用：纖維素酶是一種 ，一般認為它至少包括三種組分，即 酶、酶 酶，前兩種酶使纖維素分解成 ,第三種酶將纖維二糖分解成 。二、纖維素分解菌的篩選1 .篩

6、選方法：染色法。2 .篩選原理：剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質形成 ，但并不和水解后的纖維二糖和葡 萄糖發生這種反應，當纖維素被纖維素酶分解后,紅色復合物無法形成，出現以 為中心的透明 置，我們可以通過 來篩選纖維素分解菌。三、試驗設計土壤中纖維素分解菌的分離的實驗方案：分解纖維素的微生物的分離的試驗流程1 . 土壤取樣：采集土樣時，應選擇富含 的環境。2 .選擇培養： 閱讀資料二“選擇培養基”，回答以下三個問題：R思考13纖維素分解菌選擇培養基屬于 培養基，原因是什么？。R思考23培養基選擇作用機制是什么？R思考33若設置一個對照實驗說明選擇培養的作用，應控制的變量是什么?(1)目的：增

7、加纖維素分解菌的 ,以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。(2)制備選擇培養基：參照課本旁欄中的比例配制。(3)選擇培養：稱取土樣20 g ,在無菌條件下加入裝有30mL培養基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在上，在一定溫度下振蕩培養12 d ,直至培養液變 。也可重復選擇培養。(4)梯度稀釋：依次將培養液稀釋10四：結果分析與評價1為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行 實驗，纖維素酶的發酵方法有 發酵和 發酵。2纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產生的 含量進行定量測定。典型例題分析【例1】分析下面培養基的配方：KH2PQ、NaHPQ MgSO-7H0、葡萄糖、尿素、瓊脂。請回

8、答： 在該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別 和。(2)想一想這種培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？107倍。思考是如何操作的？(5)將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上制備培養基：參照課本旁欄中的比例。倒平板操作。涂布平板：將稀釋度為 104106的菌懸液各取0. 1 mL涂布在平板培養基上，30c倒置培養。(6)剛果紅染色法：挑選產生 的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。R思考43本實驗流程與尿素分解菌的分離實驗流程有哪些異同？3.剛果紅染色法：常用的剛果紅染色法有兩種即 兩種方法的優點與不足：R思考53為什么選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物？【

9、例2】用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106 的培養基中得到以下幾種統計結果，正確的是（）A 涂布了一個平板，統計的菌落數是230B涂布了兩個平板，統計的菌落數是215 和 260，取平均值238C 涂布了三個平板，統計的菌落數分別是21、 212 和 2 墨 6，取平均值163D 涂布了三個平板，統計的菌落數分別是2l0 、 240 和 250，取平均值233【例3】用來判斷選擇培養基是否起到了選擇作用需要設置的對照是（ ）A.未接種的選擇培養基B.未接種的牛肉膏蛋白月東（全營養）培養基C.接種了的牛肉膏蛋白月東（全營養）培養基D.接種了的選擇培養基【例4】纖維素

10、酶可以將下列哪種物質分解（）A.牛肉片 B .魚片 C .濾紙條 D .塑料條【例5】在加入剛果紅的培養基中出現透明圈的菌落是 （）A 分解尿素的細菌 B 硝化細菌C 分解纖維素的細菌D 乳酸菌【例6】本實驗關于選擇培養目的敘述正確的是（）A 可以增加纖維素分解菌的濃度B 可以減少纖維素分解菌的濃度C 所用培養基是固體培養基D 所用培養基是平板培養基基礎自測1. PCR技術要求使用耐高溫的 DNA聚合酶，這種酶要能忍受 93 c左右的高溫。如果請你來尋找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找 （）A. 土壤中B .海水中 C .熱泉中 D .冷庫中ABCDKH2PO4、 Na2HP04、KH2PO4、

11、 Na2HP04、KH2PO4、 Na2HP04、KH2PO4、 Na2HP04、2.下列能選擇出分解尿素的細菌的培養基是 （）MgS0 7H0、葡萄糖、尿素、瓊脂、水MgS0 7屋0、葡萄糖、瓊脂、水MgS0 - 7屋0、尿素、瓊脂、水MgS0 7H0、牛肉膏、蛋白月東、瓊脂、水;3. 某同學在稀釋倍數為106 的培養基中測得平板上菌落數的平均值為234， 那么每克樣品中的菌落數是（ 涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL) ()A. 2.34 X 108B . 2.34 X 109C . 234 D . 23.44 . 在做分離分解尿素的細菌實驗時， A 同學從對應106培養基上篩選出大約

12、150 個菌落，而其他同學只選擇出大約 50 個菌落。 A 同學的結果產生原因 （ ） 由于土樣不同 由于培養基污染 由于操作失誤 沒有設置對照A B C D 5 .關于土壤取樣的敘述錯誤的是 （）A 土壤取樣，應選取肥沃、濕潤的土壤B.先鏟去表層土3cm左右，再取樣C 取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D.應在火焰旁稱取土壤6下列材料中纖維素含量最高的是（ ）A.楊樹B .小麥 C .玉米D .棉花7 纖維素酶能夠分解（）A.纖維素的微生物B .淀粉的微生物 C .纖維素 D .淀粉8 剛果紅能與哪項物質形成紅色復合物（ ）A.纖維二糖 B .纖維素 C .葡萄糖 D .麥芽糖專題二課題2

13、 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數一、1(1)目的菌珠 抑制 阻止(2)特定 抑制 阻止(3)自養 能固氮的微生物；2(1)有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數。(2).稀釋度細菌30-300 顯微鏡3.非測試因素 可信度無雜菌污染二、1. 土壤，鏟去表層土。 2.培養基 多于 對照 3.培養1ml 9ml 0.1mL 4.30-300 平均數三：思考與討論(1)統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算(2)這是因為土壤中各類微生物的數量(單位：株 /kg )是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好 氧及兼性厭氧細菌數約為2185

14、萬，放線菌數約為 477萬，霉菌數約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。* (3)提供碳源的是 葡萄糖，提供氮源的的是 尿素(4)具有只有能夠以尿素作為氮源的微生物才能在該培養基上生長。(5)第 二 位同學的結果接近真實值改進的操作是第一位同學需設置重復實驗組；第二位同學統計的三個菌落數相差太大，說明操作有誤，需重新實驗。(6)方案1:其他同學用 A同學的土樣進行實驗。方案2: A同學以不接種的培養基作為空白對照。專題2課題3分解纖維素的微生物的分離參考答案:一、1.C H O 多糖2.棉花3.復合酶 C 1 Cx葡

15、萄糖昔纖維二糖葡萄糖二1.剛果紅2.紅色復合物，纖維素分解菌，是否產生透明圈三、(流程參考課本 P138) 1.纖維素2 R思考11液體，沒有添加瓊脂成分 .R思考23以纖維素粉為唯一碳源，只有纖維素分解菌才能生存。R思考33將纖維素粉改為葡萄糖。純度(3).搖床混濁(4)參照專題1的稀釋操作，(6).透明圈R思考43尿素分解菌的分離實驗流程是將土樣制成的菌懸液直接涂布在選擇培養基上；本課題通過選擇培養使細菌增殖后，再涂布在鑒別培養基上。其它操作基本基本共同。3 .一種是先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。方法一是傳統的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發生混雜；其優點是這樣顯示出的顏色 反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于在纖維素粉 和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質，可以使能夠產生淀粉酶的微生物出現假陽性反應。但這種只產生淀粉酶 的微生物產生的透明圈較為模糊，因為培養基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產生的透明圈相區分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養過程中會降解剛果紅而形成明顯的 透明圈，與纖維素分解菌不易區分。R思考53在選擇培養條件下，可使能夠適應這種營養條件的微生