1、實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 外來(lái)化合物的毒性測(cè)定外來(lái)化合物的毒性測(cè)定 Zn2+Cu2+或或Cd2+ 對(duì)小鼠對(duì)小鼠肝細(xì)胞肝細(xì)胞SOD活力的影響活力的影響 由于工業(yè)廢水的排放,重金屬污染已成為主要的環(huán)境污染之一 。重金屬進(jìn)入食物鏈后就在高位營(yíng)養(yǎng)級(jí)和低位營(yíng)養(yǎng)級(jí)之間以吞食和被吞食的方式傳送，并在生物體內(nèi)富集。已有研討闡明，鋅、銅、鎘毒性與氧化損傷親密相關(guān)，能促進(jìn)體內(nèi)活性氧自在基的產(chǎn)生，使許多組織系統(tǒng)處于氧化應(yīng)激形狀。氧自在基可直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA及多糖類(lèi)的構(gòu)造和功能受損，也可經(jīng)過(guò)使生物膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷膜的構(gòu)造。總之它們經(jīng)過(guò)改動(dòng)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)或膜脂質(zhì)的過(guò)氧化來(lái)誘發(fā)不同組織的氧化性損傷。

2、在細(xì)胞內(nèi)還存在著去除自在基的體系，主要有SOD,CAT, GSH-Px等。超氧化物歧化酶(SOD) 幾乎存在于一切動(dòng)物的細(xì)胞中,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,此酶能去除超氧陰離子自在基(O-2 ) ,維護(hù)細(xì)胞免受損傷,是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的抗氧化維護(hù)酶。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象本實(shí)驗(yàn)以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,從鋅銅或鎘從鋅銅或鎘毒性的氧化損傷出發(fā)毒性的氧化損傷出發(fā),測(cè)定染鋅銅或鎘測(cè)定染鋅銅或鎘后小鼠肝組織中超氧化物歧化酶后小鼠肝組織中超氧化物歧化酶SOD的活性變化的活性變化,以此討論鋅銅或鎘對(duì)小鼠以此討論鋅銅或鎘對(duì)小鼠肝臟抗氧化酶肝臟抗氧化酶SOD的影響的影響.

3、為細(xì)胞分子程度為細(xì)胞分子程度毒性機(jī)制討論和環(huán)境平安性評(píng)價(jià)提供科學(xué)毒性機(jī)制討論和環(huán)境平安性評(píng)價(jià)提供科學(xué)根據(jù)。根據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的根本原那么二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的根本原那么1 反復(fù)反復(fù)2 隨機(jī)隨機(jī)3 對(duì)照對(duì)照三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與資料三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與資料 1 實(shí)驗(yàn)儀器：冷凍高速離心機(jī)，分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)儀器：冷凍高速離心機(jī)，分光光度計(jì),天平天平,恒溫水浴鍋。恒溫水浴鍋。 2 實(shí)驗(yàn)試劑：蛋白定量實(shí)驗(yàn)試劑：蛋白定量(雙縮脲法雙縮脲法)試劑盒，試劑盒，超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，預(yù)冷的試劑盒，預(yù)冷的0.9%生理鹽水，冰醋酸，預(yù)冷的生理鹽水，冰醋酸，預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖蔗糖0.01mol/

4、LTris-鹽酸緩沖液鹽酸緩沖液pH7.4，5個(gè)不同的個(gè)不同的Zn2+Cu2+或或Cd2+濃度溶液濃度溶液400mg/L，200mg/L，100mg/L，50mg/L ，25mg/L 。3 實(shí)驗(yàn)資料：九周齡昆白系小鼠實(shí)驗(yàn)資料：九周齡昆白系小鼠36只，雌雄只，雌雄各半。各半。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 隨機(jī)分組：九周齡昆白系小白鼠隨機(jī)分組：九周齡昆白系小白鼠36只，雌只，雌雄各半。順應(yīng)豢養(yǎng)雄各半。順應(yīng)豢養(yǎng)2d后后,隨機(jī)分成隨機(jī)分成6組，每組，每組組6只，雌雄各半。只，雌雄各半。2. 染染Zn2+處置實(shí)驗(yàn)：設(shè)置處置實(shí)驗(yàn)：設(shè)置5個(gè)個(gè)Zn2+濃度梯度濃度梯度組組(400mg/L ，200mg/L，1

5、00mg/L，50mg/L，25mg/L)和一個(gè)陰性對(duì)照組雙和一個(gè)陰性對(duì)照組雙蒸水。各濃度梯度組皮下注射蒸水。各濃度梯度組皮下注射Zn2+ 溶溶液液0.5mL/小鼠小鼠, 陰性對(duì)照組皮下注射雙蒸陰性對(duì)照組皮下注射雙蒸水水0.5mL/小鼠。小鼠。3. 10%肝勻漿粗酶液的制備：皮下注射肝勻漿粗酶液的制備：皮下注射Zn2+ 溶液溶液24hr(48hr，72hr， 96hr后，頸椎后，頸椎脫臼處死后，以脫臼處死后，以70乙醇消毒外部后剖腹乙醇消毒外部后剖腹取肝，迅速用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血水后，取肝，迅速用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血水后，用干凈濾紙吸干水分，然后稱重并將肝剪用干凈濾紙吸干水分，然后稱重并將肝

6、剪碎，按每克肝加碎，按每克肝加9ml的冷勻漿介質(zhì)的冷勻漿介質(zhì) 0.25mol/L蔗糖蔗糖0.01mol/LTris-鹽酸鹽酸緩沖液緩沖液pH7.4到玻璃勻漿器中，在到玻璃勻漿器中，在冰浴中用玻璃勻漿器制備肝勻漿。在低溫冰浴中用玻璃勻漿器制備肝勻漿。在低溫離心機(jī)中離心機(jī)中3500r/min離離10min，上清液即，上清液即為為10%肝勻漿粗酶液，然后進(jìn)展蛋白質(zhì)含肝勻漿粗酶液，然后進(jìn)展蛋白質(zhì)含量的測(cè)定和量的測(cè)定和SOD活性的測(cè)定。活性的測(cè)定。4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：蛋白質(zhì)含量測(cè)定：蛋白質(zhì)含量測(cè)定按下表進(jìn)展操作：蛋白質(zhì)含量測(cè)定按下表進(jìn)展操作：空白管空白管標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管測(cè)定管蒸餾水蒸餾水/mL/mL0

7、.050.05蛋白標(biāo)準(zhǔn)液蛋白標(biāo)準(zhǔn)液/mL/mL0.050.055%5%肝勻漿肝勻漿/mL/mL0.050.05雙縮脲試劑雙縮脲試劑/mL/mL2.502.502.502.502.502.50混勻混勻,37,37水浴水浴10min10min，流水冷卻后，于波長(zhǎng)，流水冷卻后，于波長(zhǎng)540nm540nm，光徑，光徑1cm1cm，空白管調(diào)零，測(cè)定各管，空白管調(diào)零，測(cè)定各管ODOD值值蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式：蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式： 蛋白含量蛋白含量mg/ml = 測(cè)定管測(cè)定管OD/規(guī)范管規(guī)范管OD蛋白規(guī)范濃度蛋白規(guī)范濃度(61.5mg/ml)留意：留意：1 空白管與規(guī)范管均一個(gè)。空白管與規(guī)范管均一個(gè)。2檢

8、測(cè)的蛋白質(zhì)含量應(yīng)在檢測(cè)的蛋白質(zhì)含量應(yīng)在115mg/ml,假設(shè)高于此范圍假設(shè)高于此范圍,肝肝勻漿用勻漿介質(zhì)作適當(dāng)稀釋。勻漿用勻漿介質(zhì)作適當(dāng)稀釋。5 總總SOD活力測(cè)定：活力測(cè)定：總總SOD活力測(cè)定按下表進(jìn)展活力測(cè)定按下表進(jìn)展 ：試劑試劑測(cè)定管測(cè)定管對(duì)照管對(duì)照管SODSOD試劑一試劑一/mL/mL1.001.001.001.001%1%肝勻漿肝勻漿/mL/mL0.020.02蒸餾水蒸餾水/mL/mL0.020.02SODSOD試劑二試劑二/mL/mL0.100.100.100.10SODSOD試劑三試劑三/mL/mL0.100.100.100.10SODSOD試劑四試劑四/mL/mL0.100.1

9、00.100.10混勻混勻,37,37水浴水浴40min40min顯色劑顯色劑/mL/mL2.002.002.002.00混勻，室溫放置混勻，室溫放置10min10min，550nm550nm波長(zhǎng)處，光經(jīng)波長(zhǎng)處，光經(jīng)1cm1cm，以蒸餾水，以蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管調(diào)零，測(cè)定各管ODOD值值 總總SOD活力的計(jì)算公式：活力的計(jì)算公式： 總總SOD活力活力 = (對(duì)看管對(duì)看管OD-測(cè)定管測(cè)定管OD)/對(duì)看管對(duì)看管OD50%反反響液總體積響液總體積/取樣量取樣量ml組織蛋白含量組織蛋白含量(mg/ml) 留意最正確取樣量的探求：留意最正確取樣量的探求： 10%的肝勻漿，取樣量分別為的肝勻漿，取樣量分別

10、為10ul， 20ul， 30ul， 40ul， 50ul時(shí)，計(jì)算時(shí)，計(jì)算(對(duì)看管對(duì)看管OD-測(cè)定管測(cè)定管OD)/對(duì)看管對(duì)看管OD的的結(jié)果應(yīng)該在結(jié)果應(yīng)該在0.150.55之間，即百分抑制率在之間，即百分抑制率在15%55%之之間此段曲線根本呈直線關(guān)系，然后取百分抑制率在間此段曲線根本呈直線關(guān)系，然后取百分抑制率在48%50%的一管作為最正確取樣量。的一管作為最正確取樣量。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將所測(cè)的將所測(cè)的SOD活力結(jié)果列于下表：活力結(jié)果列于下表：SODSOD活力活力ZnZn2+2+濃度濃度( (mg/L)陰性對(duì)照陰性對(duì)照2550100200400小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體1小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體2小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體3小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體4小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體5小鼠個(gè)體小鼠個(gè)體6平均值平均值標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差六、作業(yè)要求六、作業(yè)要求 本實(shí)驗(yàn)為綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步訓(xùn)