1、文件名稱AB7500熒光定量PCR儀使用、維護、校準標準操作規程頒發部門制訂人：復核人：批準人：質保部制訂日期：復核日期：批準日期：執行日期版本1.0編RSOP04006制作份數份發送部門修訂記錄修訂人修訂原因修訂內容版本修訂日期1 .目的：確保熒光定量PCR儀能夠正確和正常的使用，保證擴增及結果分析的標準化、規范化。2 .范圍：適用于AB7500熒光定量PCR儀的使用及維護。3 .定義：無4 .職責：熒光定量PCR儀使用人員負責本規程的實施。質保部對本規定的有效執行承擔監督檢查責任。5 .內容：5.1 室內溫度控制在 1530 C,相對濕度 4575%。5.2 儀器操作5.2.1 依次打開電

2、腦顯示器和電腦主機的電源開關，進入 Windows界面。5.2.2 接著打開AB7500儀器電源開關，預熱 10分鐘。5.2.3 點擊7500 Software v2.3 圖標，打開軟件。5.2.4 按壓儀器托盤上的按壓位，待托盤彈出后，將所需檢測的 8聯PCR反應管或者96孔PCR反應 板放入檢測孔位，記下放置位置。檢測 8聯PCR反應管用*反應孔模塊，檢測 96孔PCR反應 板用*反應孔模塊。(檢測8聯PCR反應管需放入蓋緊管蓋的空8聯PCR反應管配平，檢測 96孔PCR反應板無需配平)5.2.5 再次按壓托盤使其滑入儀器。5.2.6 新建擴增參數模板：例如新建一個UG-63-62的模板，

3、擴增參數是 95° , 10' (95° , 10； 63°,45") X5 cycles ; (95°, 10" 62°, 35") >40 cycles ,在 62°時收集熒光信號 (HEX、FAM 信號)，20反應體系。5.2.6.1 在 Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples 中，將 Target Name 下的 Targetl 改成 FAM ; 點擊Add New Target ,將新增的 Target1改成HEX ,點擊 Repo

4、rtee下拉菜單，選擇 VIC。5.2.6.2 在 Setup-Run Method-Graphical View 中的 Reaction Volume Per Well后面輸入 20 （20 口反應體系）。選中第一個 Holding Stage，點擊 Delete Selected 刪除；在 Cycling Stage 中的 Number of Cycles后輸入5 ,在Step1中輸入時間10秒，在Step2中輸入溫度63度，輸入時間45秒， 將63度下面收集熒光圖標點掉；點擊 Add Stage 下拉菜單選擇 Cycling ,在Cycling Stage 中 的Number of Cy

5、cles 后輸入40 ,在Step1中輸入時間10秒，在Step2中輸入溫度 62度，輸 入時間35秒，在62度下面點擊圖標收集熒光。5.2.6.3 點擊 Save 下拉菜 單下的 Save As Tamplate ,文件 名輸入 UG-63-62 ,保存在默認 ab7500-config-tamplates文件夾內，關閉設置界面。5.2.7 已有擴增參數模板：在軟件 Home界面中點擊 Template ,選擇需要的模板，點擊打開。例如： UG-63-62 ,其擴增參數就是 95°, 10' （95°, 10" 63°, 45）X5 cycle

6、s ; （95°, 10" 62°, 35"） >40 cycles ,在 62°時收集熒光信號（HEX、FAM 信號），Reaction Volume Per Well :201（201反應體系）。5.2.8 在 Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples 中選擇 8 聯管擺放的位置，全部勾選 Sample 1 ; UGT1A1*6 勾選 HEX, UGT1A1*28 勾選 FAM。5.2.9 在Run-Amplification Plot中點擊 START RUN ,命名為20140101

7、-1 （當日日期+當日上機次數， 例:2014年1月1日第1次上機編號為20140101-1 ），保存在默認文件夾中，開始運行。5.2.10 結果分析5.2.10.1 PCR反應結束后自動保存結果，對擴增曲線進行分析。5.2.10.2 也可根據分析后圖像調節Baseline的Start值、End值以（用戶可根據實際，f#況自行調整，Start值可以在 315、End值可設在 520）, Threshold 值（Rn ）推薦設定為 500015000，點 擊Analyze進行分析，然后到 Plate窗口下記錄每個反應的Ct值。5.2.11 實驗結束后取出反應管（切勿打開管蓋），順序關閉AB750

8、0軟件、定量PCR儀電源，關閉電腦。5.3 儀器維護5.3.1 每周維護5.3.1.1 檢查計算機磁盤空間。如需要，將實驗文件歸檔或備份。?至少每周檢查一次計算機磁盤空間。?如果硬盤的可用空間不足其總容量的20% ,應將較陳舊的數據傳輸到備份存儲設備上保存。5.3.1.2 關閉控制7500 Instrument的計算機，30秒后再次開啟計算機。5.3.1.3 用無絨布塊（不脫毛）蘸取75%酒精清潔7500 Instrument的表面。（注：切勿使用有機溶劑清潔 7500 Instrument 。）5.3.1.4 使用75%酒精浸泡反應管托架（晾干后放回儀器內）。5.3.2 每月維護5.3.2.

9、1 執行背景校準。（可執行一次背景校準以檢查是否存在污染物）5.3.2.2 運行磁盤清理和磁盤碎片整理。?至少每月一次。?當Windows ?操作系統顯示消息提示執行碎片整理時。?切勿同時運行磁盤管理實用工具和7500 Real-Time PCR Software 。5.3.3 每半年（6個月）維護5.3.3.1 檢查燈具狀態。在 7500 Software 中，選擇 Instrument fLamp Status/Replacement以確定鹵素燈的狀態。顯示 Lamp Status/Replacement對話框：? Condition -表示以下其中一種狀況：- Good -燈具工作良好，

10、不需要更換。單擊Close。- Failed -必須更換燈具。單擊 Close ,然后按照5.3.4.3步驟更換鹵素燈。- Change Soon-燈具使用超過 2000小時；生產商建議將其更換。單擊Close ,然后決定是否更換燈具。如果決定更換，請按照5.3.4.3步驟更換鹵素燈。? Usage （Hours）-燈具已照明的總小時數。? Lamp Current -燈具的輸出電流，以安培為單位 （A）。低電流意味著燈具可能將要失效。? Date Last Replaced -上次更換燈具的日期。Lamp Status J ReplacementXCurent Lamp StatusCond

11、itl or:GoodUsage (Hours):0Lamp Current:UnknownDate Last Replaced: 10/01J2007Replace Lam|)You mustresetthe lamp timer前即 repiacins ffie lamp.| 皿臼2NOTE: The lamp timer can only be resertwhenttie instrument is idle Close在執行一次運行之前或期間,7500 Software可能顯示以下警告:消息描述Warning - Cannot detect sufficientcurrent fro

12、m在運行開始時，燈具電流彳氐于可接受水平。在lamp. Either lamp is notinstalled properly or按攵5.3.4.3步驟更換鹵素燈具之前，無法繼needs to bereplaced.續該運行。Warning - Cannot detect sufficientcurrent from7500 Software停止了該次運行，因為在運行lamp. Either lamp is notinstalled properly or中燈具電流下降到可接受水平之下。在按照needs to bereplaced.5.3.4.3步驟更換鹵素燈具之前，無法繼續該運行。在消息

13、框中單擊 OK,檢查儀器日志，然后更換燈具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000在運行開始時，燈具使用時間超過2000小時。hr. We recommendreplacing the lamp soon to單擊Cancel Run ,然后更換燈具，或者單擊ensure optimal assay performance.Continue Run。重新運行 ROI、背景、光學和染料校準。5.3.3.2 執行目標區（ROI）校正。5.3.3.3 執行背景校準。5.3.3.4 執行光學校準。5.3.3.5 執行染料校準。5.3.3.6 執行RNase

14、P儀器驗證試驗。5.3.4 其它維護任務（需要時執行）5.3.4.1 樣本塊污染清除。執行以下程序，去除 7500 Instrument樣本塊的熒光污染。熒光污染是導致背景運行失敗的常見原因，在此情況下，一個或多個反應孔會持續表現出異常的高信號。注意！切勿移去設備上的蓋板。7500 Instrument中沒有用戶可安全維修的組件。如果懷疑存在問題，請聯系生產商服務代表。全程戴上一次性無粉手套操作。找到樣本塊中受污染的反應孔（參閱5.4.2.13“如何確定污染”）。從7500 Real-Time PCR Instrument中取出反應板和托盤支架。a.按壓托盤門，將其打開。b.取出反應板和托盤支

15、架。c.關閉托盤門。以一定角度向托盤右側施加壓力。手動降低樣本塊:a.在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。b.在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 選項卡中,單擊 Start Manual Calibration 。c .在 ROI Inspector 對話框中，單擊 Move Block。d.當 ROI Inspector 對話框顯示"Block Down ”時，單擊 Done。關閉7500 Real-Time PCR Instrument ,然后拔

16、下其電源電纜。允許儀器冷卻15分鐘。打開 7500 Real-Time PCR Instrument的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內，然后推動以解開門栓。b.打開儀器前門。抬起門栓，然后將受熱的護蓋門推到儀器的背面。使用少量的雙蒸水，清潔樣本塊中被污染的反應孔:a.用移液管吸取少量雙蒸水并滴入每個受污染的反應孔中。b.抽吸并滴入反應孔中的雙蒸水數次，以沖洗反應孔。c.將用過的雙蒸水水吸入廢液瓶中。d.使用棉花拭子，擦試每個被污染的反應孔的內壁。e.使用無絨布料，吸出殘余的雙蒸水。打開 7500 Real-Time PCR Instrument 的檢查門。7500 Real-

17、Time PCR Instrument將受熱的護蓋門拉到儀器的正面。抬起門栓，然后將受熱的護蓋門緊固到交叉桿。插上電源插頭并開啟7500 Instrument 。?通過執行背景校準運行確認已消除污染（參閱 5.4.2“背景校準”）。?如果污染仍然存在，重復步驟至，然后使用95%乙醇溶液清潔樣本塊中受污染的反應孔:a.用移液管吸取少量 95%乙醇溶液并滴入每個受污染的反應孔中。b.抽吸并滴入反應孔中的溶液數次，以沖洗反應孔。c.將用過的乙醇溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應孔之后，應始終使用雙蒸水沖洗反應孔。?重復步驟至？，以沖洗樣本塊的反應孔，并驗證已清除掉污染物。?如果

18、污染仍然存在，重復步驟至，然后使用10%漂白劑溶液清潔樣本塊中受污染的反應 孔：a.用移液管吸取少量10%漂白劑溶液并滴入每個受污染的反應孔中。b.抽吸并滴入反應孔中的溶液數次，以沖洗反應孔。c.將用過的漂白劑溶液吸入廢液瓶中。重要！使用漂白劑溶液或乙醇溶液清潔反應孔之后，應始終使用去離子水沖洗反應孔。?重復步驟至？，以沖洗樣本塊的反應孔，并驗證已清除掉污染物。如果仍有污染，請與生 產商技術支持聯系。?確保受熱蓋門完全關閉并上閂。如果沒有，則7500 Software顯示錯誤消息。5.3.4.2 移動PCR儀。（更換或移動光學器件的任何部件后，必須執行ROI校準、背景校準、光學校準、染料校準以

19、及RNase P儀器驗證。）5.3.4.3 更換鹵素燈。全程戴上一次性無粉手套操作。關閉7500 Instrument ,然后拔下其電源電纜。允許儀器冷卻 15分鐘。a.注意！灼熱。7500 Instrument和燈具灼熱！燈具在使用中會變得非常灼熱。在處理燈具之前，應允許燈具冷卻 15分鐘，并戴上無粉防護手套。b.重要！為避免灼傷及縮短新燈具的使用壽命，處理燈具時請戴上一次性無粉手套。c.注意！ 7500 Instrument 按設計僅可使用 12V、75W 的鹵素燈。打開7500 Instrument的檢查門。a.將薄型螺絲刀插入檢查門邊緣處的鍵銷孔內，然后推動以解開門栓。b.打開儀器前門

20、。從儀器中取出燈具：a.向下滑動燈具釋放桿。b.用手緊緊地抓住鹵素燈并向上提，使燈具從安裝槽口中脫出。ab查看燈具并確定有無故障跡象（有故障的燈具內壁上通常有碳黑層）。將新燈具安裝至儀器上:關閉儀器前門。a.向上滑動燈具釋放桿。b.用手緊緊地握住燈具，將燈具放入帶槽口的安裝座內，然后小心地向下滑動燈具，使其到打開 ROI Inspector 對話框:在 ROI Inspector 對話框中，選擇 Lamp Control fIdle。?當儀器運行時，通過檢查門上的縫隙觀察，確保燈具發光，然后單擊Done。應看到燈光插上電源插頭并開啟7500 Instrument 。a.在 7500 Softw

21、are中, 選擇 Instrument f Instrument Maintenance Managerb.在 Instrument Maintenance Manager的 ROI 選項卡中，單擊 Start Manual Calibration 。?如果燈具發光，在 7500 Software 中選擇 Instrument Lamp Status/Replacement ,單擊Reset Lamp Timer ,然后單擊OK。如果燈具不發光，則替換的鹵素燈可能有缺陷。重新更換 燈具。如果再次更換燈具后仍不發光，檢查儀器的保險絲是否存在故障（參閱第71頁）。?更換燈具后，按順序執行以下校準。

22、請參閱：? 5.4.1目標區（ROI）校準? 5.4.2背景校準? 5.4.3光學校準? 5.4.4染料校準? 5.4.5驗證儀器性能5.3.4.4 更換 7500 Instrument 保險絲。保險絲損壞時，更換 7500 Real-Time PCR Instrument保險絲。（注意！為在長時間內防止火災，更換保險絲時請使用類型和額定值與儀器原始保險絲相同的經認可的保險絲。）全程戴上一次性無粉手套操作。關閉儀器電源，并拔下電源插頭。使用平口螺絲刀從儀器上旋松并卸下保險絲座。使用12.5A、250V、5X 20mm保險絲更換損壞的保險絲。注：電壓和電流額定值見保險絲座。插上電源插頭，然后開啟

23、儀器。如果儀器接通了電源，說明保險絲已安裝成功。注：保險絲損壞可能是由儀器供電電源波動導致。為了防止繼續出現故障，可以考慮安裝電氣保護設備，例如 UPS或其他電涌保護器。5.3.4.5 更新 Windows ?操作系統。5.3.4.6 更新 7500 Software 。5.3.4.7 監控儀器狀態（使用 Function Test對話框又主要 7500 Instrument組件執行高級診斷。一般情況下不需要執行功能測試，除非懷疑有硬件故障，或者 Life Technologies代表指示這樣做。）在 7500 Software 中，選擇 Instrument fFunction-Test 。

24、根據需要執行功能測試。要測試：所有組件-單擊 All Tests ,然后等候軟件執行所有功能測試。一個或多個特定組件-單擊以下其中一項或多項。? USB -測試 7500 Real-Time PCR Instrument和計算機之間的通用串行總線（USB）連接。如果7500 Software 能夠和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，則表示測試通過。? CCD -測試7500 Real-Time PCR Instrument 內的CCD攝像機。如果攝像機能夠拍攝 圖像，則表示測試通過。? Filter Wheel -測試7500 Real-Time PCR In

25、strument內的過濾輪。如果過濾輪控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。? Shutter -測試7500 Real-Time PCR Instrument的光學快門。如果快門控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。? Lamp -測試7500 Real-Time PCR Instrument的鹵素燈。如果燈具控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。? Thermal Cycler -測試7500 Real-Time PCR Instrument內的熱循環儀樣本塊。如果熱循環儀的控制器運行正確版本的固件，則表示測試通過。當7500 Software完成一項測試時，軟件報告該測試的通

26、過/失敗狀態，并提供結果描述。Function TestTestPass/FaiiDescriptionUSB _-1Pass|USB check passed.CCDPass|CCD check passedFiler VWioolPass|Filter Wheel check passelShutterPass|Sh utter clie;k passed.LaiTipPass|Lamp check passed.Thermo Cycler禺:PassPassThermo CyclercheckpassedClose結束測試時，單擊 Close。5.4 儀器校準5.4.1 目標區（ROI）

27、校準5.4.1.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.1.2 從貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中取出ROI校準反應板。5.4.1.3 讓ROI校準反應板溫度上升至室內溫度（約需 5分鐘）。在立即運行反應板之前，不要從包裝袋 內取出ROI校準反應板。反應孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間曝光可降低染料在反應 板中的熒光。5.4.1.4 從包裝袋中取出 ROI校準反應板。將光學薄膜留在反應板上。不要丟棄存放ROI校準反應板的包裝袋。若貯存于原始包袋中，反應板最多可重復使用三次。5.4.1.5 振蕩ROI校準反應板5秒鐘。5.4.1.6 用板式離心機將反應板離心2分鐘。ROI校準反應板必須充分混合

28、并離心。5.4.1.7 確認ROI校準反應板每個反應孔中的液體均位于反應孔底部。如果不是，則以更高的轉速及更 長的時間離心反應板。5.4.1.8 按壓托盤門，將其打開。將反應板裝入儀器中的反應板架。確保放置時反應板在反應孔板適配器中被正確對齊。（裝入標準反應板，使 A12凹口位置位于托盤的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。5.4.1.10 執行自動 ROI校準在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 的

29、ROI 選項卡中，單擊 Start Calibration 。按照向導的指示，完成校準。ROI Calibration 對話框顯示三個選項卡：? Setup -顯示ROI校準設置說明。單擊 Next提示可以打開 Run選項卡。? Run -單擊START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊 Next提示可以打開Analysis 選項卡。? Analysis -指明校準狀態（Passed/Failed ）。如果校準失敗，請參閱 5.4.1.13 "排除ROI校準故障”。5.4.1.11 執行手動ROI校準在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInst

30、rument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 選項卡中，單擊 Start Manual Calibration 。在ROI Inspector對話框中（如圖 1）:a.在 Exposure Time 字段中，輸入 2048。b.選才i Filter A （濾光器1）。圖1單擊Snapshot ,生成一張 ROI圖像。確定ROI圖像是否可接受（下圖所示為未飽和以及過飽和的圖像）?？山邮軋D像中的反應孔：?在不過飽和的前提下，必須盡可能明亮。（生成ROI校準時，如果反應孔過飽和，則顯示一條警告。）?可以含有但不是

31、必須含有紅色像素（表示飽和）。未飽和正常飽和過度飽和如果ROI圖像可接受，轉至步驟。如果 ROI圖像過飽和，將 Exposure Time降低一半,然后單擊Snapshot 。重復執行，直至獲得可接受的ROI圖像。如果無法獲得可接受的圖像，請參閱5.4.1.13 "排除ROI校準故障”。單擊Generate Calibration 。 7500 Software 采集一張截圖，然后顯示一個消息框或ROI圖像:執行:如果軟件顯示:7500 V2.0Olmaqe exposure 過 too low for valid calibratior, possible tad始交(1) Low

32、 exposure(2) Missing calibration plate(3) Lamp isar burned out(4) 5hutter ts closedThe caiibMtion process will not continue with the ourrentPlease increas* the esposure time and try dgain.ROI圖像非常模糊或者無法成功校準?？山邮艿男蕡D像注：在所有反應孔周圍出現綠色圓圈，表示反應孔成功校準。a.單擊OK。b. 將 Exposure Time 降彳氐半（參閱5.4.1.11步驟a）。c.重復步驟和。請參閱5.

33、4.1.13 "排除ROI校準故障”。驗證以下各項:?Wells Found 值為 96。" iXibjir neii? F uFile-.百 A成功校準- Wells Found 必須為96。注：綠色圓圈表示反應孔位置的目標區已足夠亮。？在ROI圖像上每個反應孔區的周圍顯示綠色圓圈。單擊 Save Calibration 。Exposure Time 重置為軟件保存濾光器 1新產生的ROI校準。在ROI Inspector的Filter Masks Loaded 區域，"OK" 出現在濾光器1旁邊。對其余濾光器重復步驟至，對每個濾光器執行校準之前，將2

34、048。當所有濾光器的Filter Masks Loaded 都顯示 OK時，ROI校準完成。工用吐lit I IT£115| IsMSCoflNl人1* 廣513亡;血中UfnRr®，0#京 LoaoBdA OKI OKFmI IntemiM ISWdH Qrd 學E> OsLOK當所有濾光器的Filter Masks Loaded都是OK時，校準完成。點擊Done。5.4.1.12 拆卸反應板（注意！灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過100。Co若剛使用過儀器,在樣本塊恢復至室溫之前，請勿觸摸樣本塊。）取出校準反應板：a.按壓托盤門，將其打開。b.取出校準反應

35、板。c.按壓托盤門，將其關閉。將校準反應板放入其包裝套中。如果要執行背景和光學校準：a.在接下來的8小時，將ROI校準反應板置于室溫下。光學校準使用ROI校準反應板。b.第二天將放入包裝套的反應板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。c.重要！不要丟棄校準反應板。如果將反應板裝在其原始包裝套內貯存，在打開其包裝后最多可重復使用反應板 3次。d.重要！執行ROI校準后，也必須執行背景校準、光學校準、染料校準以及儀器驗證。5.4.1.13 排除ROI校準故障問題/癥狀可能原因行動ROI校準失敗樣本塊可能位于降1.如果 ROI Inspector 的 CCD Control/Settings 顯示“B

36、lockROI圖像模糊低的位置。Up”，則單擊Block Up將樣本塊開CCD dWSglF EwiwTvMimH -JL " CctmX157"， 二 W |匚M we響的S flCTI* F A2.檢查確認受熱的蓋組件已被全程向前拉出,以確保托盤可以被正確推入。如果 7500 Instrument安裝了受熱蓋栓，檢查確認蓋栓處于鎖定位置。3.如果ROI校準仍然失敗， 檢查7500 Instrument內的鹵素燈狀態（參閱5.3.3.1 “監控燈具狀態”），然后，如果需要時,更換燈具（參閱5.3.4.3 “更換鹵素燈”）。5.4.2 背景校準5.4.2.1 全程戴上一次性

37、無粉手套操作。5.4.2.2 從貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中取出準備好的背景反應板。5.4.2.3讓背景反應板溫度上升溫（至少需要5分鐘）。5.4.2.45.4.2.5振蕩反應板5秒鐘。5.4.2.6用板式離心機將反應板離心 2分鐘。反應板必須充分混合并離心。確認反應板每個背景反應孔中的液體均位于反應孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應板。5.4.2.7按壓托盤門，將其打開。將反應板裝入儀器中的反應板架。確保放置時反應板在反應孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。（注：如果無法打開托盤,從包裝袋中取出背景反應板。（重要！不要丟棄存放反應板的包裝袋。若將背景

38、反應板貯存在其原始包裝套內，背景反應板最多可重復使用三次。樣本塊可能位于其"升高”位置，鎖定了托盤門位置。要降低樣本塊，選才I Instrument Calibrate , 然后退出 ROI Inspector。）5.4.2.8 在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Background 選項卡。在 Background 選項卡中，單擊 Start Calibration 。5.4.2.9 按照向導的指示，完成校準。

39、Background Calibration對話框顯示四個選項卡：? Overview -顯示校準相關信息。? Setup -顯示背景校準設置說明。單擊 Next提示可以打開 Run選項卡。? Run -單擊 START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊 Next提示可以打開 Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態（Passed/Failed）。如果校準失敗，請參閱5.4.2.12“排除背景校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.2.10 校準完成后，取出校準反應板：按壓托盤門，將其打開。取出

40、校準反應板。按壓托盤門，使其滑入儀器。5.4.2.11 將校準反應板放入其包裝套內，并將包裝好的反應板放回冷凍柜內的光譜校準套件中。（重要！不要丟棄校準反應板。如果將反應板裝在其原始包裝套內貯存，在初次打開其包裝后最多可重復使用反應板3次。）5.4.2.12 排除背景校準故障問題/癥狀可能原因行動背景校準失敗1背景反應板上的一個或多1.使用相同的背景反應板重復執行校準。個反應孔產生的光譜超過2.若校準再次失敗，請使用另一不同的背景反收器的最高限度。1應板重復執行校準。1|3.若校準再次失敗，請按卜義“如何確定污染” 的說明，確定污染源。5.4.2.13 如何確定污染若信號超過正常背景熒光的限度

41、，則表明校準反應板或樣本塊上存在熒光污染物。常見污染物 包括記號筆中殘存的油墨、一次性手套灑落的粉末及灰塵。欲確定污染來源和位置：在查看原始數據時，選擇反應板布局中數塊連續的較小區域，以找出受污染反應孔的位置。將背景反應板旋轉 180。，然后再次執行背景校準。重復步驟以找出污染物的位置。如果步驟和中找到的包含污染物的反應孔位置：?相同-則表明樣本塊中含有污染物。請按照“5.3.4.1樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。?相反-則表明背景反應板中含有污染物。丟棄當前使用的背景反應板，并使用新背景反應板執行背景校準程序。如果更換背景反應板并且取出樣本塊的污染后校準失?。簩⒂煤诩埜采w白反應

42、板裝入7500 Instrument 。按照本章的說明，執行背景校準程序。校準完成后，選擇反應板布局中的所有反應孔。查看光譜圖譜中的峰值。如果峰值：?可見-則表明7500 Instrument的光學部件可能已被污染。請與生產商聯系。?不存在-則表明樣本塊已被污染。請按照“5.3.4.1樣本塊污染清除”的說明，除去樣本塊中的污染物。5.4.3 光學校準5.4.3.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.3.2 從貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中取出ROI校準反應板。5.4.3.3 讓ROI校準反應板溫度上升至室溫（至少需要5分鐘）。5.4.3.4 從包裝袋中取出 ROI校準反應板，振蕩反應板5秒鐘

43、。（重要！不要丟棄存放反應板的包裝袋。若將ROI校準反應板貯存在其原始包裝套內，ROI校準反應板最多可重復使用三次。）（如果執行ROI校準后，將ROI校準反應板保持在室溫，則跳到步驟 5.4.3.5 ,以減少在反應板在室溫時形成的冷凝。如果ROI校準反應板位于冷凍柜中，轉至步驟 5.4.3.2。5.4.3.5 用板式離心機將反應板離心2分鐘。ROI校準反應板必須充分混合并離心。確認 ROI校準反應板每個反應孔中的液體均位于反應孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應板。5.4.3.6 按壓托盤門，將其打開。將反應板裝入儀器中的反應板架。確保放置時反應板在反應孔板適配器中被正確對齊。以一定角度向

44、托盤右側施加壓力，從而關閉托盤門。5.4.3.7 在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Optical 選項卡。在 Optical 選項卡中，單擊 Start Calibration 。5.4.3.8 按照向導的指示，完成校準。Optical Calibration 對話框顯示四個選項卡:? Overview -顯示校準相關信息。? Setup -顯示光學校準設置說明。單擊 Next提示可以打開 Run選項卡。? Run -單擊

45、START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊Next提示可以打開 Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態（Passed/Failed）。如果校準失敗，請參閱 5.4.2.12“排除背景校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.3.9 取出校準反應板：按壓托盤門，將其打開。取出校準反應板。按壓托盤門，使其滑入儀器。5.4.3.10 將校準反應板放入其包裝套中。將放入包裝套的反應板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。（重要！不要丟棄校準反應板。如果將反應板裝在其原始包裝套內貯存，在打開其包裝后最多可

46、重復使用反應板 3次。）5.4.4 染料校準5.4.4.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.4.2 從冷凍柜中取出光譜校準套件，并從套件內取出所有染料反應板。5.4.4.3 將光譜校準套件放回冷凍柜貯藏。5.4.4.4 讓染料反應板溫度上升至室內溫度（約需 5分鐘）。（重要！在立即運行之前，請勿從包裝袋內取出染料反應板。在每個染料反應板上，反應孔中的熒光染料具有光敏感特性。長時間暴露在光線中會降低反應板的熒光信號強度。）注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反應板貯存在其原始包裝內并放在冷凍柜中，則在打開包裝后 6個月內可以校準 7500 Real-Tim

47、e PCR Instrument 最多3次。5.4.4.5 在 7500 Software 中，選擇 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，選擇 Dye 選項卡。在 Dye 屏幕上，選擇 System Dye Calibration 。 單擊 Start Calibration 。5.4.4.6 按照向導的指示，完成每個反應板的校準。（重要！在每個校準中，向導將單獨指示。必須獨立設置、運行和分析每個染料反應板。）Dye Calibration對話框顯示四個選項卡： ? Ove

48、rview -顯示校準相關信息。當軟件提示獲取需要的材料時，選擇要校準的染料。? Setup -顯示染料校準設置說明。單擊Next提示可以打開 Run選項卡。當軟件提示裝入染料反應板時，按照步驟 5.4.4.10所述準備并裝載反應板。? Run -單擊 START RUN可以開始校準流程并顯示處理消息。單擊 Next提示可以打開Analysis選項卡。? Analysis -指明校準狀態（Passed/Failed）。當軟件提示分析從每個染料反應板采集的光譜時， 核實校準的狀態：? Passed 7500 Instrument 校準通過。轉到步驟 5.4.4.11 的。? Failed -75

49、00 Instrument校準失敗。請參閱 5.4.4.15“排除染料校準故障”。注：開始校準之前，儀器可能暫停一段時間（最多可達10分鐘），以允許受熱的護蓋達到正確溫度。5.4.4.7 將軟件所需的染料反應板從其包裝中取出。振蕩反應板5秒鐘。（重要！不要丟棄存放反應板的包裝袋。若貯存于原包袋中，反應板最多可重復使用3次。5.4.4.8 用板式離心機將反應板離心2分鐘。反應板必須充分混合并離心。確認反應板每個背景反應孔中的液體均位于反應孔底部。如果不是，則以更長的時間離心反應板。5.4.4.9 檢查并確保要裝入的染料反應板與在7500 Software中選取的熒光匹配。5.4.4.10 按壓托

50、盤門，將其打開。將反應板裝入儀器中的反應板架。確保放置時反應板在反應孔板適配器中被正確對齊。關閉托盤門。以一定角度向托盤右側施加壓力。（注：如果無法打開托盤，樣本塊可能位于其"升高”位置，鎖定了托盤位置。要降低樣本塊，選才? Instrument Calibrate , 然后退出 ROI Inspector 。）5.4.4.11 因為向導對每個染料校準單獨提供指示，所以請對校準的每個染料執行以下程序。? Passed 7500 Instrument 校準通過。轉到 b）。? Failed 7500 Instrument校準失敗。請參閱 5.4.4.15 “排除染料校準故障”。核實染料

51、光譜的分組：a.在反應板布局中，選擇反應板的孔。b.檢查原始數據。對于每個光譜，請確認峰值：?位于7500 Instrument 的可檢測范圍內。?無不規格光譜峰值。?出現在染料的正確通道上。如果某光譜不符合上述標準，請參閱5.4.4.15“排除染料校準故障”。注：在含有相同染料的各反應孔中，光譜位置和峰值位置的差異是由于不同反應孔之間的光學屬性及激發能存在細微差異而引起的。若所有光譜均可接受，則單擊Next。5.4.4.12 取出校準反應板：（注意！灼熱。儀器工作期間，樣本塊溫度可能超過100。C。若剛使用過儀器，在樣本塊恢復至室溫之前，請勿觸摸樣本塊。）按壓托盤門，將其打開。取出校準反應板

52、。按壓托盤門，將其關閉。將校準反應板放入其包裝套中。將放入包裝套的反應板放回貯存在冷凍柜內的光譜校準套件中。（注：如果將7500 Real-Time PCR Instrument染料反應板貯存在其原始包裝內并放在冷凍柜中，則在打開包裝后 6個月內可以校準 7500 Real-Time PCR Instrument 最多3次。)5.4.4.13 在按照指示將染料反應板取出后，單擊 Finish 。5.4.4.14 按照5.4.4.1開始操作，準備并運行下一個反應板。濾光器ROX染料TEXAS RED 染料峰值(nm)染料/光譜-520JOE染料VIC染料-550-580FAM染料SYBR Gre

53、en 染料CY3染料NED染料TAMRA染料4-610CY5染料-6705.4.4.15排除染料校準故障問題/癥狀可能原因行動一個或多個原始光 譜達到或低于校準 的可檢測閾值。?光譜校準反應板未充分離o?光譜校準反應板含有陳舊試1.卸載7500 Instrument 并查看光譜校準反應板的反應孔。若反應孔中的液體不是：-位于反應孔底部，請將反應板離心更長時間，劑或試劑體積不足。然后重復執行校準。?若止運行定制光譜校準反應-體積相等，則表明反應板未密封致使試劑揮板，染料可能濃度小足。發。請將其丟棄，并運行另一反應板。 一|2.若光譜校準反應板顯示正常，則丟棄該反應板并運行另一塊反應板。3.如果問

54、題依然存在，請與生產商聯系。注：若止運行定制光譜校準反應板，請創建另一反應板但要增加產生不足信號的染料的濃度。1個或多個原始光1?樣本塊或光譜校準反應板含請按照5.4.2 “背景校準”操作，以確認是否存在譜超過 7500有熒光污染物。污染物。若背景校準未顯示樣本塊含有污染物，則Instrument 的最高?若止運行定制光譜校準反應光譜校準反應板可能含有污染物。限量。板，染料可能濃度過大。光譜在一個以上的卜羊本塊或光譜校準反應板含1注：若止運行定制光譜校準反應板，請創建另一反濾光器中含有峰 值。有熒光污染物。應板但要降低超過可檢測限量的染料的濃度。5.4.5驗證儀器性能5.4.5.1 全程戴上一次性無粉手套操作。5.4.5.2 冷凍柜中取出 TaqMan ? RNase P 96-Well Instrument Verification Plate ,然后讓反應板溫度上 升到室溫（大約需要 5分鐘）。5.4.5.3 從包裝袋中取出 RNase P反應板。振蕩反應板5秒鐘。5.