1、神經元原代培養一、準備1 試劑1）胎牛血清滅活：血清室溫自然融解，搖勻。選用與血清瓶同規格的對照瓶一個， 并加入與血清等體積的水。對照瓶內插入12支溫度計（保證測試溫度的準確 性）。將血清瓶與對照瓶同時放入恒溫水浴箱，待溫度計所示溫度上升至56C時，定時30分鐘。滅活后分裝7 0ml/瓶，一瓶放在培養箱做無菌實驗，其余-20- 70 0c保存。2） DHank's液（g/L） ： NaCI: 8, KCI: 0.4, KH2Po4: 0.06, NazHPO42H2O: 0.06, NaHCOa： 0.35;酚紅：0.02,超純水溶解，調節PH至7.2,高壓滅菌（購自南方醫 院臨床試驗

2、中心）。3）多聚賴氨酸：避光，用超純水配制好后過濾,200 或400 3 l/tube分裝20度 儲存。母液濃度為5mg/ml，工作液濃度為0.1mg/ml （購自Sigma,P2636,100mg）。配置方法：20ml超純水溶解，分裝為1ml/管。用時加入49ml超 純水稀釋為。1 mg/ml的工作液。4） 50mM谷氨酸：超純水溶解，濾過除菌，分裝50 13 l/tube -20C保存。使用時需 將終濃度調整為25訕（購自Sigma, G8415, 100g，分子量：147.13）。配制 方 法：電子天平稱量谷氨酸1.47139,即0.01!71。1=100101。1,溶于20。011超純

3、水中配制 為50mM的谷氨酸母液。例：500ml 的 Neurobasal Medium 中力口人 Glutamate 母液（50mM） 250 P，此時終濃度約為25八M。5） 胰蛋白酶：0.25% （購自 Hyclone, SH30042.01, 100ml）。6）阿糖胞甘（AraC）母液：10mM,（阿糖胞甘，1 ： 1000稀釋用）（購自 Sigma, C1768, 100mg，分子量：243.22）;配制方法：100mg/243.220.41mM、 加入41 ml超純水溶解，配制成10mM的AraC母液。AraC工作液：10八M （半量換液，終濃度5八M ）;7 ） DNAsel（）

4、（購自 ROCHE, 100mg, 1mg=2000U,用 dWO 配成 10mg/ml 母 液，過濾分裝100 p |/tube每次使用50-100 pl）Q拉餐甘8 ）培養基FBSDMEM/F12 ：購自 Hyclone，SH30023.01B，500ml雙抗：購自GIBCO - 100mlNeurobasalMedium-A：購自 G舊CO,（新生鼠）或（孕鼠）500mlB27：購自 GIBCO, 17504-044, 10mlGlutamax-100X：購自 GIBCO, 3505061, 100ml 分離培 養基：10%FBS+DMEM/F12+雙抗 培養用 Start Medium

5、： Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25 換液用 Culture Medium： Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax 100X 5ml2 .耗材1） EMS蓋玻片：膜片鉗和激光共聚焦檢測試驗時才需要使用。2） 各型槍頭：10 d、100 pl、1000 pl、5ml3 ）細胞培養皿：4）細胞培養瓶：5）離心管：二、步驟1 .手術器械消毒:直頭眼科剪、直頭、彎頭顯微銀各1把為一套器械，準備兩套并分 別置于50ml燒瓶中，70%酒精浸泡30min。2

6、.動物：出生24小時內的SD大鼠（下稱乳鼠）約10只；3 .海馬組織分離：培養皿2個，分別加入冰凍DHank，液約5ml，至于冰盤上； 取乳鼠，用左手拇指和食指固定乳鼠頭部，酒精棉球皮膚消毒3遍，直頭眼科 剪 酒精燈火焰消毒后（下同）剪開皮膚，換第二把直頭眼科剪剪開顱骨,彎頭顯微鏡向 兩側牽拉開顱骨暴露乳鼠大腦，換第二把彎頭顯微鑲由顱底部分離乳鼠大 腦，然后 置入冰凍的DHank液中。 用直頭顯微鐐固定乳鼠大腦，將兩大腦半球分離后，用彎頭顯微鑲分離腦干后， 以直頭顯微鐐固定并敞開皮質，最后用彎頭顯微鐐由海馬游離端仔細分離海馬組織， 并剔除血管及腦膜。 將分離好的海馬組織至于加有冰凍D-Ha n

7、ks液的青霉素瓶中，用直頭眼科剪剪碎組織至約1 mr的小塊，加入約5倍組織體積的0.25%胰蛋白酶37C消化10min，加入分離培養基終止消化。機械吹打分散細胞，40叩篩網過濾，制成單細胞懸液，1000rpm室溫離心6min, 棄去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散細胞后，制成4X105個/ml的 單細胞懸液，接種在預先包被有多聚賴氨酸（PLL）的培養板內。在通以95%空氣、5%CO2,37C細胞培養箱中培養。接種72h后，加入含10訕 阿糖胞音的Culture Medium作用48h，以抑制膠質細胞的過度增殖。之后每隔兩 天 用Culture Medium換液，每次更換的量為原體積的1/2，培養12天后對神經元進行 鑒定并用于實驗。換液舉例：1月1日培養神經元，于1月4日用含AraC （10AM）的Culture Medium換液，AraC作用48小時后（1月6日）用Culture Medium