1、PCRPCR的種類及應用的種類及應用 學號：21014017 王志慧 序2021-12-281 PCRPCR的歷史的歷史操作過程操作過程引物引物步驟步驟 PCRPCR的各種變體的各種變體PCRPCR的應用的應用鑒定基因鑒定基因親子鑒定親子鑒定診斷遺傳病診斷遺傳病克隆基因克隆基因誘變誘變分析遠古分析遠古DNADNA鑒定特定表型的突變體基因鑒定特定表型的突變體基因比較基因表達量比較基因表達量 目錄目錄2021-12-283PCRPCR這項技術是由凱利這項技術是由凱利穆利斯穆利斯(Kary Mullis)(Kary Mullis)發明，并因此在發明，并因此在七年之后，七年之后，19931993年年1

2、010月，獲得了月，獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，的想法是，利用一種人工方法，和反復相同程序的方法，并利用和反復相同程序的方法，并利用一種特殊的酶一種特殊的酶即即DNADNA聚合酶聚合酶來擴增特定的來擴增特定的DNADNA片段。片段。PCR PCR 歷史歷史 2021-12-28DNA的復制 DNA DNA在復制時，雙鏈在復制時，雙鏈DNADNA解解旋成兩股分別進行。其復制過程的復旋成兩股分別進行。其復制過程的復制起點呈現叉子的形式，故稱復制叉。制起點呈現叉子的形式，故稱復制叉。以復制叉向前移動的方向為標準，一以復制叉向前移動的方向為

3、標準，一條模板鏈為條模板鏈為3355走向，在其上走向，在其上DNADNA能以能以5533方向連續合成，方向連續合成，稱為前導鏈稱為前導鏈(leading strand)(leading strand)；另一；另一條模板鏈為條模板鏈為5533走向，在其上走向，在其上DNADNA也是也是5533方向合成，但與方向合成，但與復制叉移動的方向正好相反，故隨著復制叉移動的方向正好相反，故隨著復制叉的移動形成許多不連續的岡崎復制叉的移動形成許多不連續的岡崎片段，最后在連成一條完整的片段，最后在連成一條完整的DNADNA鏈，鏈，該鏈稱為后隨鏈該鏈稱為后隨鏈(lagging strand)(lagging s

4、trand)。2021-12-285 5353的聚合作用：不是復制染色體的聚合作用：不是復制染色體而是修補而是修補DNADNA，填補，填補DNADNA上的空隙或是切除上的空隙或是切除RNARNA引物后留下的空隙。引物后留下的空隙。3535的外切酶活性：消除在聚合作的外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯誤核苷酸。用中摻入的錯誤核苷酸。5353外切酶活性：切除受損傷的外切酶活性：切除受損傷的DNADNA，可用于切口平移可用于切口平移nick translation).nick translation). 大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段是完整的DNA聚合酶的一個片段，只有在53聚合酶活性和3

5、5外切酶活性，失去了53外切酶活性。它可用于填補DNA單鏈末端成為雙鏈。 DNA聚合酶 Taq DNA Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1(Thermusaquaticus)yT1株株分離提取的分離提取的.yT.yT是是 一種嗜熱真菌，能在一種嗜熱真菌，能在70-7570-75生長生長. .存在于水生嗜熱存在于水生嗜熱菌菌(Thermus aquaticus)(Thermus aquaticus)的嗜熱的嗜熱DNADNA聚合酶，可在聚合酶，可在7474復制復制DNADNA，在，在9595仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以仍

6、具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNADNA為模板，延伸引物為模板，延伸引物，合成雙鏈，合成雙鏈DNADNA。這個酶只有。這個酶只有53DNA53DNA聚合酶活性和聚合酶活性和5353的外的外切酶活性，缺少切酶活性，缺少3535的外切酶活性。的外切酶活性。 該酶基因全長該酶基因全長24962496個堿基，編個堿基，編碼碼832832個氨基酸，酶蛋白分子為個氨基酸，酶蛋白分子為 94KDa.94KDa.其比活性為其比活性為200000200000單位單位/mg.75/mg.758080時每個酶分子每秒鐘時每個酶分子每秒鐘可延伸約可延伸約150150個核苷個核苷 酸，酸，7070延伸延伸率大于率

7、大于6060個核苷酸個核苷酸/ /秒，秒，5555時為時為2424個核苷酸個核苷酸/ /秒秒. .溫度過高溫度過高(90(90以以上上) ) 或過低或過低(22)(22)都可影響都可影響Taq Taq DNADNA聚合酶的活性，該酶雖然在聚合酶的活性，該酶雖然在9090以上幾乎無以上幾乎無DNADNA合成，合成， 但確有但確有良好的熱穩定性，在良好的熱穩定性，在PCRPCR循環的高循環的高溫條件下仍能保持較高的活性溫條件下仍能保持較高的活性. . Taq DNA聚合酶2021-12-287 PCRPolymerase Chain Reaction） 即聚合酶鏈式反應，是一種在體外快速擴增特定基

8、因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增。 它可以在試管里建立反應，經過數小時之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的DNA片段擴增數十萬倍，乃至千百萬倍，而無需通過繁瑣費時的基因克隆程序，便可獲得足夠數量的精確的DNA拷貝，所以有人亦稱為無細胞的分子克隆法。PCR的定義PCR 操作過程操作過程1、預變性、預變性Initial denaturation） 模板模板DNA完全變性完全變性對對PCR能否成功至關重要，一般能否成功至關重要，一般95加熱加熱3-5分鐘。分鐘。 2、引物退火、引物退火Primer annealing） 退火溫度一般需要退火溫度一般需要憑實驗閱歷決議。憑實驗閱歷決議

9、。 退火溫度對退火溫度對PCR的特異性有較大的特異性有較大影響。影響。 3、引物延伸、引物延伸 引物延伸一般在引物延伸一般在72進展進展Taq酶最適溫酶最適溫度）。度）。 延伸時間隨擴增片段長短而定。延伸時間隨擴增片段長短而定。 4、循環中的變性步驟、循環中的變性步驟 循環中一般循環中一般95，30秒足以使各秒足以使各種靶種靶DNA序列完全變性：序列完全變性： 變性時間過長損害酶活性，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。 5、循環數、循環數 大多數大多數PCR含含25-35循環，過多易產生非特燉循環，過多易產生非特燉條帶條帶6、最

10、后延伸、最后延伸 在最后一個循環后，反應在在最后一個循環后，反應在72維持維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。引物設計設計引物可以采取以下原則：設計引物可以采取以下原則：GC所占比例為所占比例為4060兩個引物的兩個引物的Tm，相差小于，相差小于5，并且擴增產物的，并且擴增產物的Tm與引物的相差不超過與引物的相差不超過10。黏合溫度通常比計算的最低黏合溫度通常比計算的最低Tm低低5，但是要根據經驗為不同條件下的，但是要根據經驗為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。選擇不同的黏合溫度。內部的具有自身互補性的發卡結構不超過內部的具有

11、自身互補性的發卡結構不超過4個，其二聚體中不超過個，其二聚體中不超過8個。個。3末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，并且要與模板完全末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，并且要與模板完全互補。倒數第二個最好是互補。倒數第二個最好是G/CPCR的各種變體的各種變體 反向反向PCR (Inverse PCR, PCR (Inverse PCR, IPCR)IPCR) 不對稱不對稱PCR (asymmetric PCR (asymmetric PCR)PCR) 多重多重PCRPCR 熒光定量熒光定量PCRPCRQ-PCR)Q-PCR) 反轉錄反轉錄PCR (reverse PCR

12、(reverse transcription,RT- transcription,RT- PCR)PCR) 巢式巢式PCR (NEST PCR)PCR (NEST PCR) 遞減遞減PCR(Touchdown PCR(Touchdown PCR)PCR)2021-12-2810 原理：擴增引物相反方向原理：擴增引物相反方向DNADNA 序列的技術。用反向序列的技術。用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規而常規PCRPCR擴增的是已知序列的兩引物之間擴增的是已知序列的兩引物之間DNADNA片段片段. .實驗時選擇已知序列內部沒有切點的

13、限制性內切酶實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段對該段DNADNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCRPCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究序進行分析研究. . 2021-12-2811已知序列已知序列未知序列未知序列反向PCR (Inverse PCR, IPCR)1. 1. 用一種在靶序列上沒有用一種在靶序列上沒有切點的限制性內切酶切點的限制性內切酶 消化消化大分子量的大分子量的DNA

14、DNA2. 2. 產生的大小不同的線性產生的大小不同的線性DNADNA片段群體，其中具靶片段群體，其中具靶DNADNA區段的區段的DNADNA分子長度不超過分子長度不超過2-3Kb,2-3Kb,經連接后環化成環狀經連接后環化成環狀分子分子3. 3. 按靶序列設計的一對向按靶序列設計的一對向外引物同靶序列外引物同靶序列5 5，-端互端互補序列退火結合，其延伸方補序列退火結合，其延伸方向如圖中箭頭所指向如圖中箭頭所指4. 4. 經經PCRPCR擴增產生的主要是擴增產生的主要是線性雙鏈線性雙鏈DNADNA分子，它是由分子，它是由左側的序列和右側序列首位左側的序列和右側序列首位連接而成，其接點就是限制

15、連接而成，其接點就是限制酶的識別位點酶的識別位點2021-12-2812運用：運用： 利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。 應用于染色體步移、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。局限性：局限性： 需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。 大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因

16、序列雜交。2021-12-2813 就像任何DNA一樣，PCR的雙鏈DNA產物也可以供序列測定使用。 然而，按照Sanger雙脫氧末端鏈終止法測定DNA的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版DNA。 現在已經發展出了一種專門用于制備單鏈DNA的技術不對稱PCR技術。 這種技術，除了使用的兩種引物濃度相差100倍以外，其他的方面跟常規PCR技術沒有什么本質的區別。 不對稱不對稱PCR PCR 2021-12-2814基本原理：基本原理： PCR PCR擴增所用的兩條引物中，擴增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的濃度受限制的只及高濃度的1%1%（或或2%2%）。）。 經過經過PCRPCR循環直到

17、限制循環直到限制引物耗盡之前，擴增的引物是雙引物耗盡之前，擴增的引物是雙鏈的鏈的DNADNA序列。而后，反應混合序列。而后，反應混合物中的另一種高濃度的引物，則物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的利用限制引物合成的DNADNA鏈做模鏈做模板，繼續引導板，繼續引導DNADNA合成。合成。這樣模板鏈繼續再循環，由高濃這樣模板鏈繼續再循環，由高濃度的引物合成的度的引物合成的DNADNA要比限制引要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態物多得多，而且仍保持單鏈狀態。 2021-12-2815不對稱不對稱PCRPCR的原理的原理多重多重PCRPCR 一般一般PCRPCR僅應用一對引物，通過僅應用

18、一對引物，通過PCRPCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定因子等的鑒定. .多重多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物，又稱多重引物PCRPCR或復合或復合PCRPCR，它是在，它是在同一同一PCRPCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCRPCR反應，其反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCRPCR相同相同多重多重PCRPCR的試驗步驟的試驗步驟 同一般的同一般的PCRPC

19、R操作相同，只是反應中所加入的是多對引物而不是一對引物。操作相同，只是反應中所加入的是多對引物而不是一對引物。1. DNA1. DNA提取：提?。篋NADNA提取可以用提取可以用DNADNA提取試劑盒或實驗室常用的一些提取試劑盒或實驗室常用的一些DNADNA提取方法進行。提取方法進行。2. DNA2. DNA定量：用紫外分光光度計進行定量：用紫外分光光度計進行DNADNA含量測定。含量測定。3. 3. 多重多重PCRPCR擴增：反應體系可以選定為擴增：反應體系可以選定為20l20l，50l50l等，反應體系中含有：等，反應體系中含有：DNADNA模模板，板，Mg+Mg+，dNTPdNTP，Ta

20、q DNATaq DNA聚合酶，各種引物等。根據實驗要求，設計合適的循環聚合酶，各種引物等。根據實驗要求，設計合適的循環參數。在設計循環參數時要注意兩個原則：一是退火溫度要足夠高。這是因為，參數。在設計循環參數時要注意兩個原則：一是退火溫度要足夠高。這是因為，多重多重PCRPCR技術是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而技術是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而產生一些非特異性的擴增產物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產產生一些非特異性的擴增產物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產物的生成；二是循環參數要盡量少，以利于檢測擴增產物。

21、多重物的生成；二是循環參數要盡量少，以利于檢測擴增產物。多重PCRPCR在一個反應體在一個反應體系中同時擴增多個系中同時擴增多個DNADNA段，其擴增效率并不是完全相同的，循環參數的增加，會使段，其擴增效率并不是完全相同的，循環參數的增加，會使TaqTaq酶的消耗增加，再加上每對引物相對退火效率不同，就會使擴增產物混亂，所酶的消耗增加，再加上每對引物相對退火效率不同，就會使擴增產物混亂，所以，循環次數不宜過多。以，循環次數不宜過多。4. 4. 電泳檢測及結果分析：取擴增產物電泳檢測及結果分析：取擴增產物1010與與2626載樣緩沖液載樣緩沖液( (溴酚藍溴酚藍) )混勻上樣，混勻上樣，同時加入

22、分子量標準，經同時加入分子量標準，經2 2瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠( (含含0.5g/ml E0.5g/ml E、恒壓、恒壓(200-600V)(200-600V)、電、電泳泳1-21-2小時后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結果，并拍照，記錄分析結果。小時后，置凝膠于紫外檢測凝膠分析儀觀察結果，并拍照，記錄分析結果。 多重多重PCRPCR的主要用于多種病原的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。分型鑒定。 1 1多種病原微生物的同時檢多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一測或鑒定，是在同一PCR

23、PCR反應管反應管中同時加上多種病原微生物的特中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行異性引物，進行PCRPCR擴增擴增. . 2 2某些病原微生物，某些某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個好發部位，突變或缺失存在多個好發部位，多重多重PCRPCR可提高其檢出率并同時可提高其檢出率并同時鑒定其型別及突變等可系統應用鑒定其型別及突變等可系統應用的有的有: :乙型肝炎病毒的分型乙型肝炎病毒的分型; ;乳頭乳頭瘤病毒的分型瘤病毒的分型; ;單純皰疹病毒的單純皰疹病毒的分型分型; ;杜氏肌營養不良癥的分型杜氏肌營養不良癥的分型及癌基因的檢測等

24、及癌基因的檢測等. .運用熒光定量熒光定量PCR(Q-PCR)PCR(Q-PCR) Q-PCR：是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析 將模板稀釋成一系列的濃度梯度進行PCR反應，用個這個結果作標準曲線，模板可以用已知濃度的樣品或未知濃度的樣品。用模版初始量的log值對每個稀釋樣品的Ct值作圖，兩者稱遞減的線性關系，稱之為標準曲線。作標準曲線用來評定反應條件的優化保證樣本有準確可重復的實驗結果）

25、 Q-PCR Q-PCR 熒光化學方法1 1DNADNA結合燃料結合燃料SYBR SYBR Green 1Green 1） SYBR Green 1 SYBR Green 1 是熒光定是熒光定量量PCRPCR最常用的最常用的DNADNA結合燃料，結合燃料，與與dsDNAdsDNA非特異性結合。在游非特異性結合。在游離的狀態下，離的狀態下，SYBR Green 1SYBR Green 1發出微弱的熒光，但一旦與發出微弱的熒光，但一旦與dsDNAdsDNA結合，熒光強度增加結合，熒光強度增加10001000倍。倍。 缺乏特異性；缺乏特異性；不能用于多重反應，因為不不能用于多重反應，因為不能區分不同

26、擴增子發出的熒能區分不同擴增子發出的熒光，用于單重實驗光，用于單重實驗。 2 2熒光燃料標記的序列特異性寡熒光燃料標記的序列特異性寡核苷酸引物或探針核苷酸引物或探針TaqManTaqMan和分和分子信標）子信標）TaqManTaqMan實驗實驗 主要優點：高主要優點：高特異性、高信噪比和能進行特異性、高信噪比和能進行多重反應。多重反應。 缺陷：探針的缺陷：探針的初始成本比較高和實驗設計初始成本比較高和實驗設計比較繁瑣。比較繁瑣。 熒光報告基團的種類：熒光報告基團的種類：FAM(FAM(發綠色熒光發綠色熒光) )、HEXHEX、TAMRATAMRA、Texas Red Texas Red 和和C

27、y5Cy5等等 分子信標分子信標molecular beaconmolecular beacon是是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。的淬滅基團緊緊靠近。Q-PCRQ-PCR的應用的應用（1 1熒光定量熒光定量PCRPCR數據分析，絕對定量和相對定量。數據分析，絕對定量和相對定量。 生物學家通常對下列事情感興趣：生物學家通常對下列事情感興趣：a)a)給定的血樣中的病毒顆給定的血樣中的病毒顆粒數；粒數；b)b

28、)相當量的腫瘤組織和正常組織比，相當量的腫瘤組織和正常組織比，p53mRNAp53mRNA改變了多少倍。改變了多少倍。（2 2基因表達差異分析?；虮磉_差異分析。 例如：與一個生物合成途徑有關的三個基因例如：與一個生物合成途徑有關的三個基因A A、B B、C C），選），選擇內參基因為擇內參基因為-actin-actin，在兩個樣本，在兩個樣本a a、b b中的相對表達情況。中的相對表達情況。 用用TaqManTaqMan探針探針 進行多重實驗擴增分析基因表達差異進行多重實驗擴增分析基因表達差異（3 3基因型基因型/ /等位基因分析，例如等位基因分析，例如SNPSNP檢測等檢測等（4 4轉基因

29、生物檢測轉基因生物檢測 ，比如可以準確的檢測食品中某一種轉基，比如可以準確的檢測食品中某一種轉基因成分的含量。其實就是跟野生型生物相比該基因表達量因成分的含量。其實就是跟野生型生物相比該基因表達量RT-PCRRT-PCR RT-PCR有很高的敏感性，可以用來分析不同組織，或是相同組織不同發育階段中mRNA表達狀況的相關性。2021-12-2824巢式巢式PCR PCR 巢式巢式PCRPCR是一種變異的聚合酶鏈反應是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)(PCR)，使用兩對而非一對，使用兩對而非一對PCRPCR引物擴引物擴增完整的片段。第一對增完整的片段。第一對PCRPCR引物擴增片段和引物擴增片段和

30、普通普通PCRPCR相似。第二對引物稱為巢式引物相似。第二對引物稱為巢式引物因為他們在第一次因為他們在第一次PCRPCR擴增片段的內部擴增片段的內部結合在第一次結合在第一次PCRPCR產物內部，使得第二次產物內部，使得第二次PCRPCR擴增片斷短于第一次擴增。巢式擴增片斷短于第一次擴增。巢式PCRPCR的的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式對并擴增的概率極低。因此，巢式PCRPCR的擴的擴增非常特異增非常特異 。一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，體，HIVHIV，腫瘤基因等，腫瘤基因等 巢式巢式PCRPCR，可以在，可以在106106基因組背景下檢測基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，所以特異性很好，到一個拷貝的病毒基因，所以特異性很好，但也是最容易污染的但也是最容易污染的PCRPCR。Touchdown PCR 用來避免非特異性序用來避免非特異性序列的擴增列的擴增 PCR PCR中引物的黏合溫度中引物的黏合溫度(annealing temperature)(annealing temperature)決定了黏合的特異性，決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強，但過高則不能實