1、包涵體蛋白的純化與復性1 .菌體的收集和破碎用50 ml離心管分別收集誘導表達后的培養物,8000 rpm 4離心10 min（離心時間 和速度應該都不夠）o沉淀用適量的超聲破菌緩沖液重懸。【備注】超聲破菌緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl pH8. 0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶（暫時我沒用）重懸后的菌液于冰浴中進行超聲波破碎，其條件為：功率為300W,占空比50斬每個 循環30 s,總時間20 mine破碎后的勻漿，4、12000 rpm離心15 min。分別取上清 液和沉淀進行12% SDS-PAGE分析，確定目的蛋白是否以包

2、涵體的形式表達。2 .包涵體的處理洗滌：沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液重懸后，攪拌洗滌2030 min,于,4, 12000 rpm離心15 min棄去上清液。重復一次。再用適量的50 mmol/L Tris pH8. 0溶液洗滌 一遍（以去除殘留的EDTA）,于4 12000 rpm離心15 min,棄去上清液。【備注】包涵體洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 2 mol/L 尿素，2% Triton）2%Triton X-100溶液:量取2mlTriton X700（聚乙二醇辛基苯基酸）液,加M緩沖 液98ml即可。溶解：沉淀用適

3、量的包涵體溶解緩沖液重懸，室溫攪拌5-6小時或過夜。12000 rpm 4c離心15 min,收集上清液。【備注】包涵體溶解緩沖液（即結合buffer） ： 20 mmol/L Tris-HC1 pH 8. 0. 0. 5 mol/L NaCl, 8 mol/L 尿素，0. 2 mmol/L DTT 或 100 mmol/L 0-筑基乙醵，2%Triton3 .目的蛋白的純化親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結合而滯留，其他雜蛋白會流過柱子。谷胱廿肽S-轉移酶（GST）是最常用的親和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋 白可用交聯谷胱廿肽的層析介質純化，但本方法有以下缺點：首先，蛋白上的G

4、ST必須能 合適的折疊，形成與谷胱廿肽結合的空間結構才能用此方法純化；其次，GST標簽多達 220個氨基酸，如此大的標簽可能會影響表達蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會破壞蛋 白的天然結構，難于進行結構分析，有時即便純化后再能切去除GST標簽也不一定能解決 問題。另一種可應用的親和純化標簽是6組氨酸標簽,組氨酸的咪理側鏈可親和結合銀、鋅 和鉆等金屬離子，在中性或弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與銀柱結合，在低pH 下用咪喋競爭洗脫。組氨酸標簽與GST相比有許多優點：首.先，由于只有6個組氨酸，分 子量很小，一般不需要用酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素 和胭中仍能夠保持結

5、合力；另外6組氨酸標簽無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動物, 也不影響免疫學分析。雖然有這么多的優點，但此標簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵 體、難以溶解、穩定性差及錯誤折疊等。銀柱純化時金屬銀離子容易脫落漏出混入蛋白溶 液，不但會通過氧化破壞目的蛋白的氨基酸側鏈，而且柱子也會非特異吸附蛋白質，影響 純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結合，或者需要某種特殊的輔因子，可將 該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔 因子洗脫。融合蛋白的表達和純化過程：1 .挑單菌落于3-5 ml 2YT或LB培養中，37過夜培養。2 .按1： 100的比例取過夜培養

6、液轉接。37擴大培養至0D 0.5左右。3 .加入IPTG終濃度0. 20. 4 mM/Lo 37搖床培養46h。4 . 12000g 離心 15min 去上清。按 40ml/100ml 菌液加入 1XBinding Buffer 破碎緩 沖液組成：50mM Tris pH7. 08. 5 左右，ImM EDTA ,溶菌酶(10 0g/g cell),:或 20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/lEDTA, 0. ImM PMSF, DNAse (10 0g/g cell) 細胞破 碎緩沖液中不含腺等變性劑，故不溶解包涵體。或4XPBS重懸細胞。5 .超聲波破碎

7、：占空比50%,超聲15s,停15s, 1020min.破碎后的勻漿在4, 12, 000 rpm下離心30 min,棄去上清液。6 .洗滌包涵體：2M 尿素在 50mM Tris pH7. 08. 5 左右，ImM EDTA , 10% Triton X- 100中洗滌。洗滌24h去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7. 0-8. 5左右，ImM EDTA , 10% TritonX-100,二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌48h,使包涵體變性可溶。7 .過Ni柱：Ni2 +親和層析柱純化包涵體溶解后的上清液，用銀親和層析柱純化。操作過程參照Amer sham Pharmacia

8、Biotech公司提供的操作指南進行。具體過程如下：轉移樹脂到柱子，待完全沉淀后，用 三蒸水洗滌銀親和層析柱，以除盡基質中的乙醵和空氣，并防止下一步Ni2 +沉淀；5X柱 體積的Charge Buffer充電；20X柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的Ni2 +; 10X柱體積 的Binding Buffer平衡柱子；手工上樣，根據蛋白的濃度來確定上樣體積；20X柱體積 的Binding Buffer洗滌，至檢出無蛋白，并收集流出液，用于12%SDS-PAGE電泳檢測；6X柱體積的Wash Buffer洗滌，至檢出無蛋白：Elution Buffer洗脫，每次1 mL,收集 洗脫流出液，洗脫至檢出無

9、蛋白；10X柱體積的Binding Buffer平衡。此時，即可用于 純化同種蛋白，不需重新充電。純化操作完成后，加5X柱體積的Strip Buffer洗滌，去盡Ni2 + ： 10X柱體積的三 蒸水洗滌去盡EDTA：加5X柱體積的0.5 mol/L NaOH,靜置0. 5-2 h,去沉淀的蛋白質； 三蒸水洗滌，至流出液的pH值為7.0： 20%乙醇洗滌，再加適量20%乙醵，于，4保存。A、過柱前的注意事項：a、樣品必須澄清、無顆粒物，否則會堵塞柱子、縮短其使用壽命；b、包含體洗滌的最后一步及溶解時所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME：c、確保樣品及Binding Buffer中

10、有適量的NaCl,以防止雜離子與Ni離子競爭；B、過Ni柱的操作步驟：用DDW洗滌，洗去20%的乙爵、除盡基質中的空氣，并能防止下一步中Ni離子沉 淀：5X 柱體積的 Charge Buffer (50mM NiSO4)充電：5X柱體積的DDW洗滌，去游離的Ni離子； 10X柱體積的 Binding Buffer (20mM Tris-HCl, 0. 5M NaCl, 5mM 咪嗖,pH8. 0)平 衡：上樣(手工上樣，樣品體積應根據目的蛋白的濃度來確定)；10X柱體積的Binding Buffer洗滌，至無蛋白檢出，用三氯醋酸檢測，收集流出 液：Elution Buffer (20mM Tr

11、is-HCl, 0. 5M NaCl, 500 lOOOmM 咪哇，pH8. 0)洗脫，每 次1ml,應呈現正態分布(兩邊稀，中間濃)：10X柱體積的Binding Buffer洗滌。此時，即可用于純化同種蛋白，很少需要重 新充電。用20%的乙醇充滿柱子，保存在4co注：同種蛋白純化510次后，應進行strip和re-charge。C、柱的清洗與保存(最好每天清洗一次)：(1)去Ni離子：5X柱體積的 Strip Buffer (20mMTris-HCl, 0. 5M NaCl, 50mM EDTA, pH7. 4)洗滌;10X柱體積的DDW洗滌。(2)去沉淀的蛋白質：5 X柱體積的0. 5M

12、 NaOH裝滿柱子，靜置0. 52hr：DDW洗滌，至流出液的pH值為7。(3)保存：20%乙醇洗滌，再加20%乙醇保存于4。D、柱的再生：當流速很慢、充電后基質不變成藍綠色時，應進行柱的再生。2 X柱體積的6M鹽酸胭洗滌，然后3 X柱體積的DDW洗滌；IX柱體積的2%SDS洗滌；5X柱體積的0.5M NaOH裝滿柱子，靜置0.52hr：5X柱體積的DDW洗滌，然后5X柱體積的100mM EDTA, pH8.0洗滌；3X柱體積的DDW洗滌，然后3X柱體積的20%乙醇洗滌；20%乙醇保存于4。【備注】Ni2+親和層析柱純化緩沖液(lXBuffer)：?/Preagents Tris-HCl pH

13、7. 9 Imidazole NaCl EDTA NiS04 Binding Buffer 20 mM 5 mM 0. 5 M Wash Buffer 20 mM 60 mM 0. 5 M Elute Buffer 20 mM IM 0. 5 M Strip Buffer 20 mM 0. 5 M 100 mM Charge Buffer50 mM M 121.14 60.0858. 44 372. 24 262. 854.目的蛋白的SDS-PAGE分別取加有IPTG的空載體pET22（b+）表達的上清液、未加IPTG和加IPTG誘導的重組 子全提取物、超聲波破碎后的上清液和沉淀（即包涵體）、

14、純化后的蛋白溶液，進行12% SDS-PAGE分析。通過蛋白質分子量標準，判斷目的蛋白的相對分子質量，并對純化后的蛋 白進行純度分析。5、蛋白質的復性目的蛋白在大腸桿菌中以包含體形式存在，要獲得有活性的產物，必須對純化的目的 蛋白進行復性。將收集的洗脫流出液裝入透析袋，對含適量甘油的0.01 mol/L PBS PH8.0 透析48 h,每48 h更換一次PBS溶液。然后，將上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中， 對蛋白溶液進行濃縮。【備注】PBS配方:酉己制 0.01 M PH 7.4 PBS2L：0.2 mol/L Na2HPO4 (mL)81.00.2 mol/L NaH2P04 (mL)19

15、.017 gNaCL用水稀釋到2 L即可。另外，可加入下列重折疊（復性）介質:氧化還原系統：還原/氧化型谷胱廿肽（10:13:1）L-Arg 或 Gly (0.5mol/L)甘油:10%聚乙二醵（濃縮）高摩爾濃度的Tris(0.4-lmol/L)L學習親和層析的原理。2.掌握親和層析法分離蛋白質的技術與操作。【實驗原理】親和層析是以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白 質，這樣的方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質對金屬離子具有親和力是這種方法的理論 依據。已知蛋白質中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與銀或銅離子形成 比較穩定的絡合物，因此，連接上銀或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪噗基和旅 基的肽和蛋白質。過渡金屬元素