1、轉(zhuǎn)錄組和差異分析研究雌性橈足類(lèi)柱形寬水蚤存活率導(dǎo)讀背景：橈足綱動(dòng)物是遠(yuǎn)洋食物的基本組成部分，但是關(guān)于其自然種群繁殖的分子基因報(bào)道仍然很少。作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析研究了地中海那不勒斯收集的雌性橈足類(lèi)柱形寬水蚤，該物種在浮游動(dòng)物中占主導(dǎo)地位。對(duì)連續(xù)幾周收集的成年雌性進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異分析。作者旨在檢測(cè)可能影響自然種群中橈足綱繁殖潛能且其表達(dá)可能受到浮游植物來(lái)源的脂環(huán)素影響的關(guān)鍵基因，脂氧化酶的相關(guān)產(chǎn)物會(huì)顯著影響橈足綱幼蟲(chóng)的存活。結(jié)果：采樣日期的溫度、鹽度、pH和氧氣都保持一致，同時(shí)觀察浮游植物細(xì)胞濃度，脂蛋白濃度和硅藻細(xì)胞中脂蛋白含量的變化。5月23日，幼蟲(chóng)存活率為25%，5月23日為93%。轉(zhuǎn)錄

2、組從頭組裝得到268665個(gè)轉(zhuǎn)錄本和120749個(gè)基因，其中50%具有注釋功能。在兩個(gè)采樣日期差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本共有331個(gè)，其中119條序列進(jìn)行了功能注釋。共有144個(gè)差異表達(dá)基因，注釋了31個(gè)。大多數(shù)顯著下調(diào)的基因是A5假定氣味結(jié)合蛋白，其他差異表達(dá)基因與發(fā)育代謝過(guò)程，蛋白質(zhì)泛素化和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。采用qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果1   環(huán)境、化學(xué)和生物變量 關(guān)于非生物(溫度、鹽度、pH和氧氣)、浮游植物和氧脂素在兩個(gè)選定日期的變化的信息見(jiàn)表1。非生物變量在兩個(gè)采樣日期之間沒(méi)有顯示出很大的變化而浮游植物群落豐度和組成有更明顯的變

3、化。T檢驗(yàn)的結(jié)果表明,使用早期數(shù)據(jù)評(píng)估幼蟲(chóng)存活率（25%和93%）見(jiàn)圖1。 表1. 非生物變量，浮游植物組成和氧脂素。2017年5月23日和30日在lelt - mc測(cè)量的環(huán)境變量、浮游植物豐度和組成、羥脂素濃度和羥脂素/硅藻細(xì)胞(羥脂素/硅藻細(xì)胞)含量。總體而言，5月23日浮游植物濃度(14.74 106 cells/L)低于5月30日(17.64 106 cells/L)。同樣，5月23日(202.82ng/L)的羥脂素濃度也高于30日(173.47ng/L)。 圖1.橈足類(lèi)柱形寬水蚤反應(yīng)。在兩個(gè)采樣日期，測(cè)量了成年雌性的平均糞便顆粒和產(chǎn)卵量及平均卵孵化成功率

4、。通過(guò)T檢驗(yàn)分析差異。 2   轉(zhuǎn)錄組從頭組裝和功能注釋 對(duì)兩次采用的幼蟲(chóng)提取RNA，并進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。過(guò)濾后，共產(chǎn)生132Mreads。使用Trinity軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了從頭組裝共得到268665條isoforms，包含120749個(gè)unigenes。對(duì)isoforms和unigenes進(jìn)行了功能注釋。 Blast2Go結(jié)果顯示，大概10%的匹配unigenes與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似序列具有很高的同源性。總體而言，超過(guò)42%的序列具有很高的同源性。Blast2Go注釋結(jié)果顯示，在62,648個(gè)unigenes中，有31,346個(gè)得到了功

5、能注釋(50.04%)。共有126358條GO terms分配到生物過(guò)程(BP, 36.77%),分子功能(MF, 35.57%)和細(xì)胞組件(CC、27.66%)中(圖2)。大多數(shù)unigenes注釋到代謝和細(xì)胞過(guò)程(29%)、綁定和催化活性(分別為32.55%和49.59)和細(xì)胞或細(xì)胞部分(20%)。 圖2.GO注釋分析。共有3個(gè)GO大類(lèi)分別為生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成。 3   差異表達(dá)分析和轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證 對(duì)5月30日和5月23日采集的樣品進(jìn)行表達(dá)水平的分析，共有144個(gè)差異表達(dá)基因。5月23日，有108個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，36個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。

6、在144個(gè)差異表達(dá)基因中，有31個(gè)(6個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào))進(jìn)行了GO注釋?zhuān)ū?）。 表2.差異表達(dá)基因。 為了進(jìn)一步分析基因功能，作者對(duì)isoforms進(jìn)行了差異表達(dá)分析。其中差異表達(dá)的isoforms共有331條，下調(diào)199條，上調(diào)132條。有119條序列進(jìn)行了GO注釋。總體來(lái)說(shuō)，主要分為GO三大類(lèi)其中BP和MF比例類(lèi)似，CC比例較小（圖3）。有趣的是，一些GO terms的isoforms在23日顯著上調(diào)或下調(diào)（圖3）。在BP子類(lèi)中，參與ATP代謝，細(xì)胞通訊，細(xì)胞響應(yīng)刺激，細(xì)胞定位的通路的isoforms下調(diào)表達(dá)。與此相反，參與分解代謝過(guò)程，細(xì)胞組分等過(guò)程的isofor

7、ms上調(diào)表達(dá)。 圖3 .差異表達(dá)isoforms的GO注釋。GO功能三大類(lèi)分別為生物過(guò)程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）。上調(diào)isoforms用藍(lán)色表示，下調(diào)isoforms用紅色表示。 對(duì)5月23日和5月30日的unigenes和isoforms進(jìn)行聚類(lèi)分析見(jiàn)圖4。5月23日，大多數(shù)顯著下調(diào)的unigenes和isoforms被注釋為A5假定的氣味結(jié)合蛋白。其他下調(diào)的unigenes被注釋為與發(fā)育代謝過(guò)程(涉及幾丁質(zhì)和膠原)、蛋白質(zhì)泛素化、應(yīng)激反應(yīng)(主要是熱休克蛋白70)、氧化還原反應(yīng)和水解酶活性等功能。同樣，其他下調(diào)亞型參與呼吸、蛋白質(zhì)結(jié)合、跨膜運(yùn)

8、輸和細(xì)胞發(fā)育。顯著上調(diào)的unigenes和isoforms主要參與生殖、細(xì)胞發(fā)育和增殖、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和受體活性。基于這些結(jié)果，選擇了9個(gè)unigenes和3個(gè)isoforms進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，引物見(jiàn)表3。其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖5）。 圖4. 差異unigenes的聚類(lèi)熱圖。列舉類(lèi)表明樣本相似性，行聚類(lèi)表明基因相似性。 表3.用于RT-qPCR驗(yàn)證的unigenes和isoforms。 圖5. 轉(zhuǎn)錄組和RT-qPCR結(jié)果比較。藍(lán)色代表RNA-seq，黃色代表RT-qPCR。討論  傳統(tǒng)上，在野外和實(shí)驗(yàn)室研究中，通過(guò)估

9、算早期生活史變量，如卵產(chǎn)率、孵化成功率和非取食(NI/NII)無(wú)節(jié)節(jié)的存活率，可以推斷橈足動(dòng)物種群的潛力。從這個(gè)角度來(lái)看，了解哪些分子機(jī)制有助于生物生存能力，可能有助于預(yù)測(cè)自然橈足動(dòng)物種群的生殖反應(yīng)。特別是，作者的差異分析可能有助于闡明從那不勒斯灣(GoN)自然種群中采集的雌性橈足綱柱形寬水蚤存活能力的分子機(jī)制。有關(guān)環(huán)境變量、浮游植物群落組成和豐度、每升氧脂素濃度和每硅藻細(xì)胞氧脂素產(chǎn)生的信息，可以闡明這些變量對(duì)雌性同足動(dòng)物的分子反應(yīng)和最終的無(wú)節(jié)蟲(chóng)生存能力的影響。 本研究的轉(zhuǎn)錄組分析產(chǎn)生了268,665條isoforms和120749個(gè)unigenes，這些數(shù)字明顯高于其他橈足類(lèi)動(dòng)物。

10、相反，作者的結(jié)果更接近于C. finmarchicus的結(jié)果。在本研究的轉(zhuǎn)錄組分析中，BLAST比對(duì)的前20種的物種中絕大多數(shù)是甲殼類(lèi)動(dòng)物，而前兩種最受歡迎的物種是橈足類(lèi)廣腹足目和太平洋美洲鱷。盡管，只有近50%的isoforms和unigenes在BLASTx中比對(duì)上，約25%的這些序列得到了GO注釋。如此低的百分比表明，盡管目前的結(jié)果表明從以前的從頭轉(zhuǎn)錄分析中得到了改進(jìn)，但改善橈足類(lèi)的基因組資源仍需要付出很大的努力。 在描述了從頭轉(zhuǎn)錄組組裝和注釋之后，作者驗(yàn)證了差異分析是否可以幫助推斷參與無(wú)節(jié)細(xì)胞存活的母體相關(guān)分子過(guò)程。作者比較成年雌性產(chǎn)生高度可行的無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)(5月30日)與雌性產(chǎn)

11、生無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)存活率較低(5月23日),發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)序列主要是參與信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生殖和發(fā)育過(guò)程。 更特別的是，大多數(shù)在5月23日被下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本都是公認(rèn)的氣味結(jié)合蛋白。其中大部分為A5結(jié)合蛋白。氣味結(jié)合蛋白(Obps)是節(jié)肢動(dòng)物嗅覺(jué)系統(tǒng)的一部分，在黑腹果蠅模型中廣泛存在。在這種生物中，Obp表達(dá)的抑制介導(dǎo)了一種固定的行為反應(yīng)和對(duì)苦味劑攝入的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果支持了果蠅中Obps參與有害化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。事實(shí)上，Obps被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)果蠅對(duì)植物毒素的消極反應(yīng)，因?yàn)镺bps 57d和57e允許識(shí)別植物衍生的己酸和辛酸。在D. melanogaster中，作為對(duì)嗅覺(jué)刺激的反應(yīng)，Obp調(diào)控突出的一個(gè)最重

12、要特征是Obp基因的表達(dá)是組合的。這意味著對(duì)氣味刺激的反應(yīng)是由多個(gè)obp的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)的。 相對(duì)于D. melanogaster中Obp調(diào)控的廣泛功能信息，據(jù)作者所知，這是第一次在橈足類(lèi)動(dòng)物中報(bào)道這些序列的差異表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果證實(shí)了橈足類(lèi)柱形寬水蚤雌蟲(chóng)A5 Obp的下調(diào)，可能對(duì)5月23日攝食有害獵物和低繁殖產(chǎn)量起相關(guān)作用。這些結(jié)果表明，Obps可以代表重要的靶基因和蛋白質(zhì)，以研究橈足類(lèi)動(dòng)物如何對(duì)浮游植物來(lái)源的化學(xué)物質(zhì)作出反應(yīng)。 低存活率也可能與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A (Ppa2)的下調(diào)有關(guān)，因?yàn)檫@種酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面的重要作用。絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶，如PP1

13、、PP2A和PP2B，介導(dǎo)Bcl-2/ bcl - x相關(guān)死亡促進(jìn)因子(BAD)的去磷酸化，這是一種促凋亡蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PP2A活性可由磷酸二酯酶(PDEs)調(diào)控，PDEs通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP水平抑制PP2A活性，影響排卵前卵泡的卵母細(xì)胞墊化和卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。正如作者的差異分析，Pde下調(diào)，這一反應(yīng)可能導(dǎo)致更高的cAMP水平和更強(qiáng)的刺激Ppa2作為補(bǔ)償性機(jī)制來(lái)重新平衡失調(diào)的凋亡。 直接參與生殖和發(fā)育過(guò)程的差異表達(dá)序列也可能在分子水平上顯示出寬水蚤存活率的巨大差異。甲基四氫葉酸脫氫酶(Mthfd)是上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。葉酸單碳代謝在動(dòng)物的發(fā)育和疾病反應(yīng)中起著重要作用。食物的代謝是復(fù)

14、雜的，因?yàn)樗婕暗綆追N酶的活性。有效的葉酸形式是四氫葉酸(THF)，它是參與胸苷酸、嘌呤、甘氨酸、絲氨酸和同型半胱氨酸生物合成的輔助因子。從這個(gè)角度來(lái)看，Mthfd表達(dá)的改變可能有助于解釋作者研究中寬水蚤最終繁殖成功的障礙。 5月23日收集的T. stylifera中其他與細(xì)胞發(fā)育和繁殖相關(guān)的序列上調(diào)，如me31b、Vldlr和Vasa。這些基因在生殖細(xì)胞形成中起關(guān)鍵作用，也在卵母細(xì)胞發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用。 差異分析也暗示了蛋白內(nèi)吞作用和多糖降解功能的改變，作者推測(cè)這可能是5月23日觀察到的低無(wú)節(jié)細(xì)胞活性的原因。在這些序列中，Ap-2表現(xiàn)出顯著的下調(diào)。Ap-2參與網(wǎng)格蛋白

15、依賴的內(nèi)吞作用，蛋白質(zhì)被網(wǎng)格蛋白(CVV)包圍成囊泡。因此，Ap-2與核內(nèi)體和溶酶體系統(tǒng)都有密切的關(guān)系，對(duì)基本的細(xì)胞過(guò)程至關(guān)重要。Arsb 主要用于多糖的消化，是一種添加性下調(diào)的unigene, RT-qPCR結(jié)果支持這種差異表達(dá)。ARSB在糖胺聚糖(GAG)的降解中發(fā)揮核心作用，該基因的調(diào)控改變可導(dǎo)致多糖的溶酶體排泄。最后，參與氧化磷酸化鏈的幾個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，如細(xì)胞色素氧化酶亞基I和細(xì)胞色素氧化酶亞基II，也下調(diào)表達(dá)。結(jié)論  總的來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)錄組水平上收集的信息顯示，產(chǎn)生低生存能力無(wú)節(jié)的寬水蚤雌蟲(chóng)表現(xiàn)出對(duì)最終繁殖成功至關(guān)重要的代謝過(guò)程蛋白編碼的下調(diào)或上調(diào)。在分子水平上，

16、參與ATP合成、細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因可以解釋5月23日觀察到的母細(xì)胞介導(dǎo)的無(wú)節(jié)細(xì)胞低存活率。差異表達(dá)的序列也可以表明寬水蚤雌蟲(chóng)調(diào)控的抵消負(fù)性生殖潛能的分子途徑。從這個(gè)角度來(lái)看，已知一些差異表達(dá)的基因編碼相互連接的蛋白，參與細(xì)胞生化模式，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、卵黃前體細(xì)胞(YPP)、基因表達(dá)和自噬。這些過(guò)程可以部分解開(kāi)協(xié)調(diào)的分子途徑，導(dǎo)致改變的寬水蚤活力。有趣的是，參與解毒的關(guān)鍵基因，如醛脫氫酶、超氧化物歧化酶或谷胱甘肽合酶，在寬水蚤雌蟲(chóng)中沒(méi)有差異表達(dá)。 雖然作者不能排除本研究未考慮的生物和非生物因素可能影響橈足類(lèi)動(dòng)物的分子反應(yīng)，但作者的數(shù)據(jù)表明，溫度、氧氣、pH和鹽度起到了邊緣作用，因?yàn)檫@些因素在兩個(gè)采樣日期中保持不變。此外，寬