1、bcl2基因轉(zhuǎn)染對人胃上皮細(xì)胞 GES一） 作者：朱麗華，李淑英， 周洪霞，習(xí)瑾昆，章廣玲，周天戟 【關(guān)鍵詞】bcl2 基因 【Abstract 】 AIM : To observe the effect of bcl2 gene transfection on the proliferation of human gastric epithelial cell GES1. METHODS : The eukaryotic vector carry ing the full le ngth of bcl2 gene and the n eomyc in resista nee gene (pc

2、DNA3/bcl2) and the one only carry ing the n eomyc in resista nee gene (pcDNA3) were amplified and purified. The plasmid of pcDNA3/bcl2 was used to tran sfect GES1 cells by using the lipofectami ne, and the empty vector pcDNA3 to tran sfect GES1 cells as con trols. And the n, the cells were cultured

3、in 1640 culture medium containing an appropriate concen trati on of G418 for selectio n. The method of HRP label immuno histochemical sta ining was used to ide ntify the cells express ing bcl2 gene positively. The morphologic cha nges of GES1 cells were observed un der an optical microscope by HE st

4、a ining. The cell proliferati on affected by the tran sfecti on of bcl2 was measured by cell coun ti ng and MTT assay. RESULTS: bcl2 gene and the vector pcDNA3 were tran sfected separately into GES1 cells by lipofectami ne. After G418 selectio n, the cells were tran sfected steadily. Compared with c

5、on trols, HRP label immuno histochemical stai ning showed that bcl2 gene tran sfected cells expressed Bcl2 prote in much more obviously. No morphologic cha nges were observed by HE sta ining. The growth curve was draw n by the method of cell counting ，which showed that the growth of bcl2 gene transf

6、ected cells was faster tha n that of empty vector tran sfected cells and untran sfected cells after 6 d culture. And MTT assay showed that the growth of bcl2 gene transfected cells were 4.15 0.31，5.98 0.56 and 8.94 0.79, respectively. While MTT assay showed that the growth of control cells were 3.01

7、 0.20， 4.76 0.52 and 7.69 0.84, respectively. Sign ifica nt differe nces were found betwee n the 2 groups (P0.05). CONCLUSION: The tran sfected of bcl2 gene makes the cells express Bcl2 protein steadily and highly, and enhan ces the cells proliferati on and malig nancy. 【Keywords bcl2 gene; transfec

8、tion; gastric mucosa; epithelial cell; GES1; proliferati on 【摘要】 目的：觀察 bcl2 基因脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胃上皮細(xì)胞系 GES1 及其轉(zhuǎn)染后 對GES1 細(xì)胞增殖的影響.方法：以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染構(gòu)成 bcl2 基因表達(dá)的人胃上 皮細(xì)胞系 GES1 細(xì)胞模型， 空載體質(zhì)粒 pcDNA3 專染 GES1 細(xì)胞及正常 GES1 細(xì)胞 為對照；經(jīng)酶標(biāo)免疫組織化學(xué)法鑒定 bcl2 基因表達(dá)陽性細(xì)胞；用 HE 染色法進(jìn) 行形態(tài)學(xué)觀察；并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及 MTT 法分析 bcl2 轉(zhuǎn)染后對 GES1 細(xì)胞增殖的 影響結(jié)果：脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 bcl2 基因

9、后，細(xì)胞高表達(dá) Bcl2 蛋白；HE 染色后形 態(tài)學(xué)觀察無明顯改變；細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示 bcl2 基因轉(zhuǎn)染 6 d 后細(xì)胞生長速度明顯超過對照組， MTT 法結(jié)果顯示 bcl2 基因轉(zhuǎn)染第 24,48,72 h，A490 nm 值分別為 4.15 0.31，5.98 0.56，8.94 0.79，對照組分別為 3.01 0.20，4.76 0.52，7.69 0.84，兩組相比較具有顯著性差異 （P0.05）. 結(jié)論：bcl2 基因轉(zhuǎn)染使 GES1 細(xì)胞穩(wěn)定且高表達(dá) Bcl2 蛋白，并促進(jìn)了細(xì)胞增殖 【關(guān)鍵詞】bcl2 基因；轉(zhuǎn)染；胃黏膜；上皮細(xì)胞； GES1 增殖 0 引言

10、胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的發(fā)展過程 .bcl2 是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡調(diào) 控基因，其異常表達(dá)與胃癌、宮頸癌、胃腸道等腫瘤發(fā)生發(fā)展尤為密切 1-3 我們探討 bcl2 基因在人胃上皮細(xì)胞系 GES1 中的表達(dá)情況，探討該基因表達(dá)量 與人胃上皮細(xì)胞生長特性之間的關(guān)系如下. 1 材料和方法 1.1 材料正常人胃上皮細(xì)胞系 GES1 本室保存；質(zhì)粒 pcDNA3 由日本北海道大學(xué) 醫(yī)學(xué)部遺傳醫(yī)學(xué)研究所腫瘤病毒學(xué)部門高田賢藏教授惠贈(zèng)； Lipofectamine、 DME 培養(yǎng)液、RPMI 1640 培養(yǎng)液、MTT 胎牛血清購于 Gibco 公司；小鼠抗 Bcl2 （一抗） 、 HRP 標(biāo)記山羊抗小

11、鼠 IgG （二抗） 購于北京華美生物制品公司； Olympus光學(xué)顯微鏡為日本 Nik on 公司產(chǎn)品. 1.2 方法細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染參照 Lipofectamine 4轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)染 48 h 后，換用含 300 mg/L G418 的完全培養(yǎng)基篩選.取待染細(xì)胞爬片， 固定， 滴 加 30 mL/L H2O2,室溫孵育 15 min，滴加 1 : 100 稀釋的小鼠抗 Bcl2 mAb， 4C濕盒中過夜，PBS 洗，滴加山羊抗小鼠 IgG HRP 結(jié)合物， 37C,孵育 30 min, PBS 洗滌， DAB 容液顯色 5 min，PBS 終止反應(yīng)；自來水充分沖洗，系列 乙醇脫水，二

12、甲苯使其透明，中性樹膠封片，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 Bcl2 蛋白的表達(dá). 轉(zhuǎn)染 bcl2 的 GES1 細(xì)胞經(jīng) HE 染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并照相.另接種細(xì)胞于 24 孔 培養(yǎng)板中，每孔接種 3X106/L.每天取 3 個(gè)孔計(jì)數(shù)，測出每孔中的細(xì)胞總數(shù)， 求出每組平均值，持續(xù)計(jì)數(shù) 10 d,繪制生長曲線.細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板 中，培養(yǎng) 24,48,72 h 后每孔加入MTT 溶液（5 g/L ） 20 卩 L，37C，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液.每孔加入 DMSO 150 卩 L,振蕩 10 min,使結(jié)晶物充分溶解.選擇 490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各 A 值

13、，記錄結(jié)果.空載體質(zhì)粒 pcDNA3 專染 GES1 細(xì)胞及正常GES1 細(xì)胞為對照. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 x s表示，用 SPSS 11.5 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間 比較用單因素方差分析，兩兩比較使用 Dunnettt 檢驗(yàn). 2 結(jié)果 2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 Bcl2 蛋白表達(dá)與對照組(GES1 和 GESI/PcDNA 組)比較，免疫組 織化學(xué)染色法顯示 bcl2 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有 Bcl2 蛋白表達(dá)，且明顯高于對照組 (圖 1).另經(jīng) HE 染色，光鏡觀察，bcl2 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)未見 改變 2.2 細(xì)胞生長速度繪制生長曲線結(jié)果表明 bcl2 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞于第 4 日后

14、生長速 度明顯高于對照組(圖 2).培養(yǎng) 24,48 和 72 h 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖明顯增高， 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，轉(zhuǎn)染組和對照組相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P0.05,表 1).表 1bcl2 基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖(略) 3 討論 Bcl2 高表達(dá)是對各種凋亡刺激的保護(hù)，因此 Bcl2 低表達(dá)或缺失的細(xì)胞死亡率 明顯增加.bcl2 基因被證明在抑制細(xì)胞向凋亡的轉(zhuǎn)變中起重要作用 ，可以抵抗 和抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的存活力，參與細(xì)胞增殖與凋亡動(dòng) 態(tài)平衡的調(diào)控 5-6:.轉(zhuǎn)染 bcl2 基因可抑制化療藥物、 加熱、 放射線、 細(xì)胞 生長因子撤銷、 cmyc或 p53 基因等多種因素誘導(dǎo)的多種

15、細(xì)胞的凋亡，延長細(xì)胞 生存時(shí)間7-8.我們用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，將含有人 bcl2cDNA 的真 核表達(dá)載體 pcDNA3 導(dǎo)入人胃上皮細(xì)胞系 GES1 成功地建立了 100%穩(wěn)定表達(dá) Bcl2 蛋白的 GES1bcl2. 【參考文獻(xiàn)】 1史朝暉,姜希宏,靳文武,等抑凋亡基因 bclx L 在胰腺癌組織中的表達(dá) 及意義J山東醫(yī)藥,2003,43 (36) :9-10. 2夏克棟，陳向敏，林巧愛，等.NFKb、IKb、Bcl2 在宮頸癌組織中的表 達(dá)及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)系J癌癥,2005,24 (11) :1350-1353. 3孫梅，張興義，鄒洪杰，等.CyclinD1、Ki67 和 Bcl2 在胃腸道間質(zhì)瘤 的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系J中華胃腸外科雜志,2005,8 (6) :542-543. 4王賢輝，梁米芳，李德新，等.鼠 bclX_L 基因在 CHO胞中的表達(dá) J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24 (24) :2217-2219. 5李俊峽，賈國良，金明，等.轉(zhuǎn)染 bcl2 基因?qū)π募〖?xì)胞活力的影響 J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24 (2) :110-112. 6王長洪，陸宇平，馮新莉，等.黃苔胃病患者胃黏膜凋亡基因及相關(guān)蛋 白的表達(dá)J中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2004,12 (1):13-