1、.蛋白質放射性碘化標記實驗 【目的】1. 掌握最常用的氯胺-T法碘化蛋白的要領2. 學會用柱分離純化碘化蛋白的方法3. 學會標記率、比放射性、放射性化學純度的計算【原理】NaCl蛋白質碘化是利用蛋白質分子上的酪氨酸殘基和碘正離子的置換反應，Na 125I中的125I在氧化劑（氯胺-T或Iodogen、過氧化物酶等）作用下，被氧化成125I2，將酪氨酸殘基中酚基鄰位氫置換下來，即獲得碘化的蛋白質。氯胺-T化學名稱為N-氯代對甲苯碘酰胺鈉鹽，分子式為CH3- -SO2N它在水中產生次氯酸，是一溫和的氧化劑。161616······

2、3;···········222A1 B1 C1121 11121 11121 1116121 11 2 2 2圖3. 放射紙層析圖（單位：cm）【試劑與器材】 1、試劑：1% BSA（pH 7.5 0.05 MPD配制）0.4 ml10%三氯乙酸（TCA）10 ml74 KBq/50 l Na 125I 50 l50 g/50 l BSA(pH 7.5，0.5 MPB配制)50 l氯胺T、偏重亞硫酸鈉各10 mg臨用前1 ml pH 7.5, 0.5 MPB溶解10% KI 250

3、l0.5 MPB pH7.5 50 l0.05 MPB pH 7.5 100 ml葡聚糖凝膠 Sephadex G-50 5010 g1% NaI 20 ml2、器材：1 ml玻璃移液管 2支尖頭滴管 2支一次性塑料試管 80支10 l微量注射器 2支200 l 微量加樣器 2支200 l微量加樣器頭 10個青霉素小瓶（帶塞） 1個（內裝1小磁棒）分離柱（1×20 cm） 1個電磁攪拌器 1臺18×6 cm濾紙（Whatman I或新華1號）1條用鉛筆如圖1所示做好標記，A、B、C三處用前各滴5 l 1% NaI，冷風稍微吹干。層析缸 1個 吹風機 1個 剪子 1

4、把 鑷子 1把 計數儀 1臺 圖4 . Sephadex 柱層析圖【操作步驟】1.Sephadex G-50柱的制備：稱Sephadex G-50 510 g, 50 ml蒸餾水泡過夜或沸水浴中煮40，傾去上清，沉淀加入pH 7.5, 0.05 M PB 50 ml混勻使成懸液，裝入清潔的層析柱，如圖2所示，使Sephadex G-50均勻沉積至20 cm，多余的吸出，勿使柱干掉。加0.4 ml 1% BSA飽和柱，以減少Sephadex對125I-蛋白質的物理吸附，提高過柱后125I-蛋白質的利用率。在1%BSA通過柱的同時，用1% TCA檢查BSA流出柱的情況，以供收集125I-蛋白峰作參

5、考。1、 取裝有磁棒的青霉素小瓶1個，在電磁攪拌機上依次加入以下試劑：50 ug/50 ul BSA 50 ul74 KBq/50 l Na 125I 50 l10 mg/ml氯胺-T 50l電磁攪拌下反應210 mg/ml偏重亞硫酸鈉100 ul終止反應10% KI 250 l用微量注射器從500 l反應混合物中準確吸出5 l點于濾紙A處，冷風稍吹干。另取5l加入一小試管中，測量投入125I的總量。3剩余反應混合液用微量加樣器移至預先用1% BSA飽和的Sephadex G-50柱，再用250l 10%溶液洗反應瓶，追加上柱，待全部反應液完全進柱后，開始用pH7.5，0.05 M PB洗脫，流速約每分鐘10滴，每管收集10滴（約0.5 ml），逐管收集。為防止125I-蛋白在收集管上吸附，各管可預先用BSA或與標記蛋白無關的動物血清飽和，如凍干馬血清。4放射性測量：依次測定各收集管的放射性計數，以計數率為縱坐標，管數為橫坐標作圖，可得兩個放射性峰，第一個峰為125I-BSA，第二個峰為125I。將第一峰各管集中，用微量注射器準確取出5l點于濾紙B處，冷風稍吹干余者存冰箱待用。另取約5l Na 125I滴于濾紙C處，冷風吹干。5展層：以10% TCA為展開劑，液面稍低于樣品位置