1、會計學1本章的主要內容常見的細胞壁結構細胞破碎技術包涵體的純化方法第1頁/共72頁概述第2頁/共72頁概述第3頁/共72頁概述第4頁/共72頁定義第5頁/共72頁微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜。通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。不同細胞壁的結構和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同。細胞壁結構對破碎的影響第6頁/共72頁Z 幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；Z 相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯，構成了細胞壁的三維網狀結構，包圍在細胞周圍

2、；Z 使細胞具有一定的形狀和強度。第7頁/共72頁u破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構，其網結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度。u革蘭氏陰性菌的細胞壁結構與革蘭氏陽性菌有很大不同。 u革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過這種細胞生產了很多細胞重組的產物。藥物名稱藥物名稱宿主宿主用途用途胰島素胰島素大腸桿菌大腸桿菌治療糖尿病治療糖尿病人生長激素人生長激素大腸桿菌大腸桿菌治療侏儒病治療侏儒病- -干擾素干擾素大腸桿菌大腸桿菌治療毛狀細胞白血病等治療毛狀細胞白血病等第8頁/共72頁第9頁/共72頁酵母細胞壁的結構示意圖u最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了

3、細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，u上面的是一層糖蛋白，u最 外 層 是 甘 露 聚 糖 ， 由1,6-磷酸二酯鍵連接成網狀。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的復合物。u破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。第10頁/共72頁第11頁/共72頁細胞壁的組成和結構微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽性細菌陽性細菌革蘭氏革蘭氏陰性細菌陰性細菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90

4、%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質蛋白質脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質蛋白質葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質蛋白質(6-8%)(6-8%)脂類脂類(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類脂類蛋白質蛋白質第12頁/共72頁細胞破碎技術第13頁/共72頁細胞破碎技術第14頁/共72頁細胞破碎技術第15頁/共72頁細胞破碎方法及其原理機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法

5、物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學破碎有機溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎第16頁/共72頁機械破碎法又可分為：高壓勻漿破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超聲波破碎法（ultrasonication）第17頁/共72頁進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）

6、一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。在珠液分離器的協助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出從而實現連續操作。破碎中產生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Bead mill）原理：第18頁/共72頁Netzsch LM-20型珠磨機l 園盤以兩種位置交錯地安裝在軸上，l 一種處于徑向，一種與軸傾斜，l 徑向盤使磨料沿徑向運動，傾斜盤則產生軸向運動。l 由于交錯的運動，提高了破碎效率。A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤C-環形震動俠縫分離器D-變速馬達1和2料液進出口3和4 攪拌冷卻劑進出口5和6磨室冷卻劑進出口第

7、19頁/共72頁珠磨機破碎作用方程u 破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符合下列公式： ln1/(1-x)=Kt x 破碎率；K一 一級反應速度常數；t一 時間。u K與攪拌轉速、細胞懸浮液濃度和循環速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產物的失活、減少由于高破碎率產生的細胞小碎片不易分離而給后續操作帶來的困難。該式中t在間歇操作時為破碎操作時間，連續操作時為細胞懸浮液在破碎室內的平均停留時間，即t=V/Q V為破碎室的有效體積（即為懸浮液的體積），Q為料液流量。第20頁/共72頁膠體磨德國進口珠磨機第21頁/共72頁p

8、甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化 圖2-1甘蔗葉片總RNA Fig.2-1Total RNA isolated from sugarcane leaf 圖2-2甘蔗莖總RNAFig.2-2 Total RNA isolated from sugarcane stem 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示28S、18S和5S rRNA特征條帶清晰，說明得到的總RNA完整性好，沒有可見的降解，也無明顯的基因組DNA污染。結果與分析第22頁/共72頁甘蔗葉片和莖mRNA呈彌撒分布，長度都分布在0.53 kb范圍內，完全符合建庫要求。 圖2-3 mRNA電泳檢測結果 Fig.2-3 Agaros

9、e gel analysis of mRNA M: 1kb marker; 1: 葉片mRNA; 2: 莖mRNAM: 1kb marker; 1: leaf,s mRNA; 2: stem,s mRNAp甘蔗葉片和莖總RNA的提取及mRNA的分離純化結果與分析第23頁/共72頁p雙鏈cDNA（dscDNA）的合成及檢測 圖2-4甘蔗葉片雙鏈cDNAFig.2-4 The dscDNA of sugarcane leaf 圖2-5 甘蔗莖雙鏈cDNA Fig.2-5 The dscDNA of sugarcane stem甘蔗葉片和莖dscDNA都分布在0.53 kb之間。說明所獲得的dscD

10、NA是完整的。甘蔗葉片和莖dscDNA圖片差異較大，是用于電泳檢測的dscDNA用量差異造成。 結果與分析第24頁/共72頁2.高壓勻漿法（High-pressure homogenization）利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環上，被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。原理：大規模細胞破碎的常用方法，在微生物細胞和植物細胞的大規模處理中常采用第25頁/共72頁高壓勻漿器的排出閥第26頁/共72頁第2

11、7頁/共72頁p易造成堵塞的團狀或絲狀真菌p較小的革蘭氏陽性菌p含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細胞類型。 第28頁/共72頁大、中、小型高壓勻漿器第29頁/共72頁u超聲波破碎法（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞懸浮液。u超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。u超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關。3.超聲破碎法（Ultrasonication）第30頁/共72頁第31頁/共72頁第32頁/共72頁第33頁/共72頁機械法的缺點（1）需要高的能量并且產生高溫和高

12、的剪切力，容易使不穩定產品變性失活；（2）就破碎的有機體或釋放的產物而論，它們是非專一的，并且產生碎片微粒尺寸的大范圍細分布，大量細顆粒給分離帶來了困難。第34頁/共72頁第35頁/共72頁1.酶溶法（Enzymatic Lysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內切酶殼多糖酶等酶解是利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。第36頁/共72頁（1）外加酶法第37頁/共72頁（1）外加酶法第38頁/共72頁u優點：產品釋放的選擇性高；抽提的速率和收率高；產品的破壞最少；條件溫和，對PH值和溫

13、度等外界條件要求低；不殘留細胞碎片。u缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差，產物抑制的存在。酶溶法的優缺點第39頁/共72頁 （2）自溶法（Autolysis）u 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。u 在微生物代謝過程中，大多數都能產生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續下去。u 自溶作用：改變其生長環境（溫度、緩沖液），可以誘發產生過剩的這種酶或激發產生其它的自溶酶，以達到自溶目的。u 缺點是：易引起所需蛋白質的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。第40頁/共72頁某些化學試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，

14、可以改變細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內物質有選擇地滲透出來。2.化學滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學試劑的類型以及細胞壁膜的結構與組成。 第41頁/共72頁（1）酸、堿處理法采用酸堿調節溶液的PH值，改變細胞所處的環境，從而改變兩性產物蛋白質的電荷性質，使蛋白質之間或蛋白質與其他物質之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。第42頁/共72頁（2）表面活性劑無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細胞壁上的脂蛋白結合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解細胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS

15、，陰離子型）；非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等對疏水性物質具有很強的親和力，能結合并溶解磷脂，破壞內膜的磷脂雙分子層，使某些胞內物質釋放出來。第43頁/共72頁u能被細胞壁脂質層吸收后，使胞壁膜溶脹，細胞破裂，胞內物質被釋放出來。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機溶劑u與水中氫鍵作用，削弱溶質分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。第44頁/共72頁u通用性差；u時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50% ；u有些化學試劑有毒 。u化學試劑的加入常會給隨后產物的純化帶來困難，并影響 最終產物純度。化學滲透法優

16、缺點：缺點：優點：l對產物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內；l細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。第45頁/共72頁2.物理法（Physical permeation）第46頁/共72頁第47頁/共72頁u將細胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復多次而達到破壁作用。u一方面使細胞膜的疏水鍵結構破裂，另一方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞膨脹而破裂。u適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次。 第48頁/共72頁3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥使細胞結合水分喪

17、失，從而改變細胞的滲透性。當采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內物質就容易被抽提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。冷凍干燥適用于不穩定的生化物質第49頁/共72頁第50頁/共72頁選擇破碎方法的依據第51頁/共72頁選擇性釋放目標產物的一般原則僅破壞或破碎存在目標產物的位置周圍u當目標產物存在于細胞膜附近時，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結融化法等。當目標產物存在于細胞質內時，則需采用強烈的機械破碎法u當目標產物處于與細胞膜或細胞壁結合的狀態時，調節溶液PH值，離子強度或添加與目標產物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面

18、活性劑等，使目標產物容易溶解釋放。(2)機械破碎法和化學法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標產物釋放率條件下，降低細胞的破碎程度。第52頁/共72頁破碎率的測定與破碎技術的研究方向 1. 破碎率的測定1) 直接測定法2) 目的產物測定法3) 導電率測定法采用染色法把破碎的細胞與未破碎的細胞區別開來。如破碎的革蘭氏陽性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產物含量或活性，并與100%破碎率的標準值比較，計算其破碎率。細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。 第53頁/共

19、72頁2.破碎技術的研究方向1) 多種破碎方法相結合2) 與上游過程相結合3) 與下游工程相結合第54頁/共72頁基因工程表達產物后處理的特殊性基因工程菌培養液不同表達形式的前處理(胞外分泌型表達：離心,收集液相濃縮純化。(胞內表達：l胞內可溶性表達：離心,收集菌體細胞破碎離心，收集上清純化l胞內周質表達：離心,收集菌體低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物離心,收集上清液純化。l不溶性包涵體：離心,收集菌體細胞破碎離心,收集沉淀包涵體洗滌目標蛋白變性溶解復性純化。第55頁/共72頁蛋白蛋白產物占菌體總蛋白產物占菌體總蛋白外源蛋白的積累外源蛋白的積累人胰島素人胰島素50%50%形成包涵體形成包涵

20、體 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在細胞間區在細胞間區- -人體干擾素人體干擾素25%25%形成包涵體形成包涵體凝乳酶原凝乳酶原形成包涵體形成包涵體牛生長激素牛生長激素30%30%形成包涵體形成包涵體 - -內酰胺酶內酰胺酶形成間區包涵體形成間區包涵體人胰島素原人胰島素原5%26%5%26%形成包涵體形成包涵體第56頁/共72頁包含體的形成Z 包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。Z 包涵體的形成：大腸桿菌中目標產物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產物聚集在細胞內，形成不溶性的包涵體。Z 高表達產

21、生的積聚物在細胞內部形成不溶物原因？ 蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子內部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀；表達蛋白過多，與其結合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態 蛋白質自身不穩定。第57頁/共72頁收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標蛋白的變性溶解目標蛋白的復性包含體的出現不僅增加了生物分離設計的難度，也為蛋白質折疊機理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態的目標產物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。第58頁/共72頁機械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復性第59頁/共7

22、2頁路線1 的特點第60頁/共72頁機械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復性第61頁/共72頁路線2 的特點第62頁/共72頁化學破碎（加變性劑）離心除細胞碎片除變性劑復性第63頁/共72頁 路線三：第64頁/共72頁1）包涵體的洗滌l細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。l洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。l洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。l洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產物為原則。第65頁/共72頁 2）包涵體的變性溶解 包涵體中不溶性的目標蛋白必須溶解到液相中，才能進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如1-2 SDS，作用：破壞蛋白質肽鏈