1、高效液相色譜的操作步驟及常見問題分析高效液相色譜的常見問題分析高效液相色譜儀操作步驟1) 過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。2) 對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。3)打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。4)進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動菜單。5)有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力

2、越大，一般不要超過2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。7) 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。8)進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點(diǎn)擊p

3、ostrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9) 關(guān)機(jī)時，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。10) 填寫登記本，由負(fù)責(zé)人簽字。 注意事項(xiàng)：1)流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。2) 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。3) 所有過柱子的液體均需嚴(yán)格的過濾。4) 壓力不能太大，最好不要超過2000 psi提高HPLC檢測限、溶劑脫氣等的幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn) 僅針對用反相碳十八烷基硅烷化填料的柱子和紫外檢測器的HPLC通常在理論教學(xué)時，HPLC分析總要求實(shí)用HPLC純的試劑、用孔徑比填料粒度小的微

4、孔濾膜過濾流動相、最好用真空或氦氣脫氣。實(shí)際上，按照不同的精確度，有時候并不需要做得那么嚴(yán)格。這里首先申明，雖然許多做法是我的經(jīng)驗(yàn)，但請讀到這篇文章的朋友自己做個判斷，如果按我說的做，造成任何損失，我深表遺憾，但我不承擔(dān)任何責(zé)任。這篇文章僅供交流和討論。      關(guān)于HPLC純。我想這里關(guān)鍵是兩點(diǎn)：純度高、紫外吸收小。純度高一方面，沒有雜質(zhì)干擾測定；另一方面不會有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。但如果你的HPLC分析的是直接用分析純試劑制備而沒有其他色譜純?nèi)軇┫♂尣襟E而且是中藥之類的dirty sample（臟樣

5、品）；那么用自己重蒸的分析純?nèi)軇┮部梢粤耍?dāng)然還有一點(diǎn)是紫外吸收也要同時符合要求。這對于黃芩苷一類含量高、紫外吸收大的樣品足夠了。如果懶得自己重蒸，也可以用些便宜的色譜純試劑。事實(shí)上，據(jù)我所知，許多所謂的色譜純也是國內(nèi)制備灌國外品牌的瓶子賣的。水嘛，用去離子水就行了，也就是市售的純水。水的紫外吸收與甲醇、乙腈相比，小得很，主要考慮不要有金屬離子和細(xì)菌。不過，千萬別買了假的純水。保險(xiǎn)做法，找家大的純水供應(yīng)點(diǎn)，買水回來，做一下紫外掃描、做下菌檢、再來個水硬度檢查，行的話就固定用他的。      濾膜過濾，除非是無機(jī)鹽，否則我均不過濾，定期

6、把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性就行了。能過過濾頭的東西就讓它過吧，懶得理它，有人可能會考慮堵塞的問題，沒等它堵，我的柱子都會壞了，把柱子前面一點(diǎn)挖了，添上新的，就行了，當(dāng)然這里操作要小心。至于長菌，能在甲醇里長，我也沒辦法了。      如果是高壓二元梯度泵，用超聲脫氣就行了。把溶劑瓶放到59kz的超聲清洗機(jī)超至沒有白白的氣泡上來就行了。四元的是混合后脫氣，比較重要，一般都會配脫氣機(jī)，我也沒用過，不說了。如果是要求檢測限很小的分析，有幾點(diǎn)建議，    首先，如果是等度洗脫，

7、一定要改成單元等度，即流動相混合到一個瓶子里；第二，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，乙腈紫外吸收小，相同條件下，噪音小很多；在前兩樣都解決不了，那只好通氦脫氣了。梯度洗脫，如果像人參皂苷之類的，盡量用乙腈/水系統(tǒng)洗脫，不行就通氦啰。    做了那么久液相，堵塞流路的事情碰過幾回，都是無機(jī)鹽配的緩沖液惹禍，都不關(guān)過濾的事。緩沖液換有機(jī)相沖柱時，有人一不注意沒沖干凈無機(jī)鹽就沖甲醇，結(jié)果就塞了。千萬要用90%左右的水先沖干凈鹽。不銹鋼管路堵了好辦，烘箱烘之，再沖開。柱子堵了，我還沒試過。      其實(shí)，做H

8、PLC通常擔(dān)心的是做不出理想的結(jié)果和壞柱子。理想的結(jié)果，主要的就靠流速精確的和檢測限。流速精確才能保證保留時間精確，這與機(jī)器性能有關(guān)，不談了。檢測限越低就等于色譜峰可以的誤差可以越小。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，二元等度會使噪音峰高大大增加，所以做等度不要用二元，除非，你的樣品峰高遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于噪音（20倍以上吧）。可以的話，使用乙腈自然比甲醇好。空氣的存在也會影響噪音，甚至是出鬼峰，還是那句，不行就通氦啰。additives（添加劑）也要注意，看看添加的三乙胺、乙酸之類的截止波長是多少，低于她的截止波長就是不透過，會極大的增大噪音。    噪音是怎樣造成的呢，就是往復(fù)泵的

9、脈沖和流動相的基礎(chǔ)吸收，用單元泵是為了降低脈沖；用乙腈就是降低基礎(chǔ)吸收。物質(zhì)的紫外吸收系數(shù)一般是固定的，降低噪音提高檢測限的出發(fā)點(diǎn)就是以上兩方面了。但是物質(zhì)在不同的溶劑里，紫外吸收系數(shù)是不一樣的，有時候添加劑也會影響，特別是酸，乙酸、磷酸、鹽酸有時候值得選擇一下。    保護(hù)柱子，就是不要堵了，不要污染。我一般不用保護(hù)柱，得不償失，國內(nèi)的不能用，國外得太貴。我就兩招：用3%乙酸溶液和甲醇二元梯度100%甲醇到10%甲醇，一小時做個來回，柱子耐不了pH10的就用1%乙酸，這東西，降柱壓有奇效，目前為止我是百試百靈；另一招就是挖柱填柱了。1. 渦流擴(kuò)散（Ed

10、dy diffusion）+ q. k5 T' z; k) f% B1 i! R0 A原因和解決方法：流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細(xì)溝，則流動相的速度就快；有的部位結(jié)塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效率高。2. 分子擴(kuò)散（Molecular diffusion）原因和解決方法：分子擴(kuò)散就是物質(zhì)分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運(yùn)動，也稱縱向分子擴(kuò)散。要減少分子擴(kuò)散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質(zhì)停留時

11、間長，則擴(kuò)散嚴(yán)重。4 V6 J4 t% 3. 質(zhì)量轉(zhuǎn)移（Mass transfer）* b& |- V. U) c7 A( P原因和解決方法：被分離物質(zhì)要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質(zhì)分子要在兩個液相之間進(jìn)行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當(dāng)流速快時，轉(zhuǎn)移速度慢，來不及達(dá)到平衡動相就向前移，這各物質(zhì)的非平衡移動，使區(qū)帶變寬。4. 動相流速原因和解決方法：當(dāng)流速太低時，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當(dāng)達(dá)到最低值時，流速再加大則質(zhì)量轉(zhuǎn)移起主要作用，理論塔板高度又加大

12、。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因?yàn)槲镔|(zhì)要滲透到凝膠內(nèi)部，所以質(zhì)量轉(zhuǎn)移影響大，流速加大會降低柱效率。5. 固定相顆粒太小原因和解決方法：固定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。# y& A, ! L- h3 U4 W: w6. 峰拖尾 ) O* h4 K7 t) z9 g' V2 A   原因和解決方法：1 I$ P/ C4 j' q+ b3 T' （1） 篩板阻塞，反沖色譜柱 ，更換進(jìn)口篩板 ，更換色譜柱 ；（2） 色譜柱塌陷，填充色譜柱；（3） 干擾峰，使用更長的色譜柱，改變流

13、動相或更換色譜柱；（4）流動相PH選擇錯誤  調(diào)整PH值。對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰； 3 （5）樣品與填料表面的溶化點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑，更改色譜柱。  7. 峰分叉  原因和解決方法：" k9 y# Q' b1 r6 Z% L2 G, z（1）保護(hù)柱或分析柱污染，取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析，如果必要更換保護(hù)柱，如果分析柱阻塞，拆下來清洗，如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱，（2） 樣品溶劑不溶于

14、流動相，改變樣品溶劑，如果可能采取流動相作為樣品溶劑。8. 早出的峰變形  1 O5 y& q0 M  _! / m原因和解決方法：7 d; N: S1 P' P. P1 v3 L樣品溶劑選擇不恰當(dāng)，減少進(jìn)樣體積，運(yùn)用低極性樣品溶劑。9. 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因和解決方法：  柱外效應(yīng)，調(diào)整系統(tǒng)連接（使用更短、內(nèi)徑更小的管路），使用小體積的流通池。 0 j( e$ + L! # V10. K增加時，脫尾更嚴(yán)重  原因和解決方法：7 2 B# S: m, S) k1 |5 d( r（1）二級

15、保留效應(yīng)，反相模式，加入三乙胺（或堿性樣品），加入乙酸（或酸性樣品），加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品），更換一支柱子； 9 k8 o4 - 3 d（2）二級保留效應(yīng)，正相模式，加入三乙胺（或堿性樣品），加入乙酸（或酸性樣品），加入水（或多官能團(tuán)化合物），試用另一種方法； （3） 二級保留效應(yīng)，離子對，加入三乙胺（或堿性樣品）。   C- L; 2 m6 Y11. 酸性或堿性化合物的峰拖尾  * L+ b9 e! l& J0 W+ v* / Q原因和解決方法：6 n- f- A3 E( i5 Y( p, g. Q; V! 緩沖不合適，使用濃

16、度50-100mM的緩沖液，使用Pka等于流動相PH值的緩沖液。 $ Z0 * T; N% a% S/ P! 12. 額外的峰  原因和解決方法： " r6 p) b$ W' O（1） 樣品中有其他組份，正常； （2） 前一次進(jìn)樣的洗脫峰，增加運(yùn)行時間或梯度斜率 ，提高流速；（3）空位或鬼峰，檢查流動相是否純凈，使用流動相作為樣品溶劑，減少進(jìn)樣體積。13. 保留時間波動  % m: q! f6 Q" S" ) k% V原因和解決方法（1） 溫控不當(dāng)，調(diào)好柱溫； 8 0 F0 2 B$ U* G/ w（2）

17、流動相組分變化，防止變化（蒸發(fā)、反應(yīng)等）；% L' O7 V8 P1 4 p/ A（3）色譜柱沒有平衡，在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。4. 保留時間不斷變化  原因和解決方法：（1） 流速變化，重新設(shè)定流速 ；" 8 j: z1 W% 4 q% , Z（2） 泵中有氣泡 ，從泵中除去氣泡 ；（3） 流動相選擇不恰當(dāng)，更換合適的流動相，選擇合適的混合流動相。15. 基線漂移  原因和解決方法：; A$ w8 i# i* d' b4 b& t, i（1）柱溫波動，（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動，通常影響

18、示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器），控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器圖；（2）流動相不均勻，（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移），使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氦氣；（3）流通池被污染或有氣體，用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸不要用鹽酸）；（4）檢測器出口阻塞，（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線），取出阻塞物或更換管子，參考檢測器手冊更換流通池窗；7 k. 9 y: S+ l& e- M+ M) z（5）流動相配比不當(dāng)或流速變化，更改配比或流速，

19、為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速；2 q  R' x& x1 S# （6）柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時，用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗；. y% D6 F7 " （7）流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成，檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑；（8）樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線，使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子；7 c/ B% Z' E! T/ 2 W5 _- d（9

20、）使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調(diào)整，重新設(shè)定基線，當(dāng)檢測器動力學(xué)范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相；（10）檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處，將波長調(diào)整至最大吸收波長處。5 j) J916. 基線噪音（規(guī)則的）  % L# z3 : * T1 G$ B原因和解決方法：（1）在流動相、檢測器或泵中有空氣，流動相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣；（2）漏液，檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要，更換泵密封；（3）流動相混合不完全，用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑；9 M- d, r5（4） 溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱），減少差異或加上熱交

21、換器； ' O! （5） 在同一條線上有其他電子設(shè)備斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正；（6） 泵振動，在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。17. 基線噪音（不規(guī)則的） & W( 8 K7 7 Q$ x原因和解決方法：（1）漏液，檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要，更換密封，檢查流通池是否漏液；（2） 流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成，檢查流動相的組成；2 + u8 |! F: （3） 流動相各溶劑不相溶，選擇互溶的流動相； , O; Z& j: R+ p, - x（4）檢測器/記錄儀電子元件的問題，斷開檢測器和記錄儀的電源，

22、檢查并更正；（5） 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)；（6） 檢測器內(nèi)有氣泡 ，清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器； % p6 （7）流通池污染（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音），用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池；（8） 檢測器燈能量不足，更換燈；9 K1 d5 4 j$ ; M7 M- ?（9） 色譜柱填料流失或阻塞，更換色譜柱；（10）流動相混合不均勻或混合器工作不正常，維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置。  * v4 B+ * E" g; 9 w  S% f18. 寬峰9 p+ u( C, z6 n

23、  r5 V! d原因和解決方法：" h3 m* w( m, _（1） 流動相組成變化，重新制備新的流動相 ；（2） 流動相流速太低，調(diào)節(jié)流速； 7 & u  p+ _5 Y（3）漏液（特別是在柱子和檢測器之間），檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音，如果必要更換密封；, Q# F/ K6 f) d* j4 x, （4） 檢測器設(shè)定不正確， 調(diào)整設(shè)定；! r# R* v& : g/ L（5） 柱外效應(yīng)影響，柱子過載，檢測器對反應(yīng)時間或池體積響應(yīng)過大，柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大，記錄儀響應(yīng)時間太

24、長，小體積進(jìn)樣（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀釋樣品，減少響應(yīng)時間或使用更小的流通池，使用內(nèi)徑為0.007-0.01的短管路，減少響應(yīng)時間；（6） 緩沖液濃度太低，增加濃度 ；（7） 保護(hù)柱污染或失效 ，更換保護(hù)柱 ；（8）色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低，更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強(qiáng)溶劑沖洗舊柱子；（9） 柱入口塌陷，打開柱入口，填補(bǔ)塌陷或更換柱子；（10）呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質(zhì)的峰，選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果；- |$ P! S$ q; Y3 z（11） 柱溫過低，提高柱溫，除非特殊情況，溫度不宜超過75 12、

25、檢測器時間常數(shù)太大，使用較小的時間常數(shù)；19. 分離度降低原因和解決方法：（1） 流動相污染或變質(zhì)（引起保留時間變化），重新配置流動相 ；（2） 保護(hù)柱或分析柱阻塞圖，去掉保護(hù)柱進(jìn)行分析，如果必要則更換保護(hù)柱，如果分析柱阻塞，可進(jìn)行反沖，如果問題仍然存在色譜柱可能被強(qiáng)保留的污染物損壞，建議使用恰當(dāng)?shù)脑偕绦颍绻麊栴}仍然存在，進(jìn)口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。20. 所有的峰面積都太小原因和解決方法：（1） 檢測器衰減設(shè)定過高，減少衰減的設(shè)定；1 ; q: " l( Z% B: U（2） 檢測器時間常數(shù)設(shè)定太大，設(shè)定較小的時間常數(shù)；（3） 進(jìn)樣量太少，增大進(jìn)樣量；

26、0;  q6 i) ( o8 W（4） 記錄儀連接不當(dāng)，使用正確的連接。 ) a' A/ w; F( / 5 Z; U9 d9 # h21. 所有的峰面積都太大 + ( T6 N$ j$ f. I# B原因和解決方法：（1） 檢測器衰減設(shè)定過低，采取較大的衰減； " E, Y8 s- G+ q( Z; ! * w（2） 進(jìn)樣過多，減少進(jìn)樣量 ；（3） 記錄儀連接不正確，正確連接記錄儀。問:用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在？如何解決？答:關(guān)于漂移問題：1 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2 流動相發(fā)生變化，解決辦法

27、是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3 柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡 關(guān)于快速變化問題 1 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2 泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 3 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合問:液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？答: 1 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子問：HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法答: 1 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 2 樣品未從柱子中流

28、出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子3 樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器4 檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 5 檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)6 檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 7 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。8 記錄儀測壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可。9 流動相流量不合適。調(diào)整流速即可。 10 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。問：做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？答：原因可能有：1 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進(jìn)行脫氣處理；2 比例閥失效，更換

29、比例閥即可； 3 泵密封墊損壞，更換密封墊即可； 4 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；5 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；6 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。問：我購買的HPLC柱驗(yàn)收測試時柱壓過高，請問為什么？答：柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；3 將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱

30、子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；4 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正常現(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點(diǎn)：    （1）、色譜柱頭的

31、過濾篩板堵塞或污染；    （2）、色譜柱頭的填料被樣品污染；    （3）、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出；    （4）、流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決辦法如下：   （1）、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。   （2）、如確定色譜柱頭的填料

32、被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。   （3）、如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。   （4）、如果因PH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù)。問：用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移，有時發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?答：關(guān)于漂移問題：?1溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等3柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡關(guān)于快速變化問題?1流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定2泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合問：液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?答：1篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子問：液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?答：1篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2