1、METHANOGENEuryarchaeota1產甲烷菌菌落特性及產甲烷菌菌落特性及分子生物學研究分子生物學研究METHANOGENEuryarchaeota2厭氧發酵微生物概述產甲烷菌分類及代謝途徑產甲烷菌富集與純化微生物群落研究方法分子多樣性研究內內 容容METHANOGENEuryarchaeota3厭氧發酵微生物概述厭氧發酵微生物概述不產不產甲烷菌甲烷菌產甲產甲烷菌烷菌纖維素降解細菌半纖維素降解細菌淀粉降解細菌脂肪降解細菌產琥珀酸絲狀菌溶纖維丁酸弧菌白色瘤胃球菌牛鏈球菌溶脂厭氧弧菌產氫產乙酸菌同型產乙酸菌揮發酸生成菌群揮發酸生成菌群基質分解菌群基質分解菌群沃爾夫互營單細胞菌中溫丙酸氧化

2、菌伍德乙酸桿菌乙酸梭菌嗜熱自養梭菌嗜甲基丁酸桿菌提供生長和產甲烷所需要的基質創造適宜的氧化還原電位條件為產甲烷菌清除有害物質METHANOGENEuryarchaeota4厭氧發酵微生物的發展史厭氧發酵微生物的發展史1901-1903年巴斯德研究所的Maze馬氏甲烷球菌. H A Barker發現沼氣發酵分為產酸和分解酸形成甲烷兩個階段1950 美國R. E .Hungate發明厭氧培養技術1868 Bechamp甲烷形成是微生物學過程1899 俄國 奧姆良將厭氧分解纖維的微生物分為兩類1916奧氏甲烷桿菌1901荷蘭 Sohngen氫和二氧化碳的混合氣能發酵成甲烷1967 Bryant采用改

3、進Hungate技術純化產甲烷菌1972 三階段理論1974 Bryant首次提出了產甲烷菌(Methanogen)一詞更先進的技術更完善的體系METHANOGENEuryarchaeota5產甲烷菌的生物學特性產甲烷菌的生物學特性專性厭氧專性厭氧生長繁殖困難生長繁殖困難-320mV下正常生長 -160mV 下生長緩慢 遇氧停止生長甚至死亡十幾天幾十天才出現菌落菌落一般圓形、透明、邊緣整齊菌落特別小，很容易遺漏。可利用的底物很少：可利用的底物很少：CO2、H2、乙酸、甲醇、乙酸、甲醇、甲基胺等甲基胺等METHANOGENEuryarchaeota6產甲烷菌的生物學特性產甲烷菌的生物學特性特殊的

4、細胞壁結構特殊的細胞壁結構獨特的產甲烷菌輔酶獨特的產甲烷菌輔酶甲烷吠喃(MFR)甲烷喋呤輔酶M(CoM)輔酶F430輔酶F420HS-HTP無肽聚糖骨架蛋白質亞基和大量雜多糖組成不受青霉素抑制細胞內無細胞色素C脂蛋白肽聚糖脂多糖孔道蛋白METHANOGENEuryarchaeota7產甲烷菌的分類產甲烷菌的分類根據可利用底物根據生長溫度氫營養型：利用氫氣和二氧化碳氫營養型：利用氫氣和二氧化碳乙酸鹽營養型：乙酸乙酸鹽營養型：乙酸甲基營養型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其甲基營養型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其他的一些醇如異丙醇、異丁醇、乙醇、環戊醇他的一些醇如異丙醇、異丁醇、乙醇、

5、環戊醇嗜冷產甲烷菌：嗜冷產甲烷菌：T Toptopt 25 8080METHANOGENEuryarchaeota8產甲烷菌甲烷生產途徑產甲烷菌甲烷生產途徑H H2 2/CO/CO2 2途徑途徑乙酸途徑乙酸途徑甲基途徑甲基途徑CO2 + H2 CH4 + 2H2O G0= -131 kJ 4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O G0= -319 kJ CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- G0= -31 kJ CO2 + H2 CH4 + 2H2O G0= -131 kJ 4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O G0= -319 kJ CH3COO- + H2

6、O CH4 + HCO3- G0= -31 kJ METHANOGENEuryarchaeota9產甲烷菌的分類產甲烷菌的分類顆粒污泥外觀特征顆粒污泥外觀特征顆粒污泥表面的菌群顆粒污泥表面的菌群馬氏甲烷球菌馬氏甲烷球菌巴氏甲烷八疊球菌巴氏甲烷八疊球菌甲酸甲烷桿菌甲酸甲烷桿菌METHANOGENEuryarchaeota10產甲烷菌的分類產甲烷菌的分類METHANOGENEuryarchaeota11產甲烷菌顯著影響因子產甲烷菌顯著影響因子微量元素缺乏會導致VFA高，氣體產率下降。對毒性物質具有拮抗作用使反應器內優勢菌種發生變化使乙酸利用率提高數倍。微量元素硫酸鹽還原細菌和產甲烷細菌存在競爭關系

7、，二者都以氫、乙酸、乳酸等為電子供體。硫化氫致害濃度為50 mgL-1，馴化后的500 mgL-1。硫酸鹽最適pH值6.8 7.4pH值的變化可引起微生物體表面的電荷變化，影響培養基中有機化合物的離子化作用酶只有在最適宜的pH 值時才能發揮最大活性。產甲烷菌最適宜的Eh為-350 mV 或更低，過高則停止生長甚至死亡。中溫Eh 應低于-300-380 mV高溫厭氧消化系統-500-600 mVpH值氧化還原電位(Eh)METHANOGENEuryarchaeota12產甲烷菌富集與純化方法產甲烷菌富集與純化方法樣品采集樣品采集繁殖培養繁殖培養純化分離純化分離純度檢驗純度檢驗水沉積物、沼澤、苔原

8、、稻田、瘤胃、盲腸、地熱溫泉等碳源、氮源、維生素、微量元素、還原劑、指示劑培養基配好后先煮沸數分鐘厭氧操作箱中進行接種操作，充入體積比4:1的H2/CO2培養10天后，重復上述過程四次。滾管分離 涂片染色檢驗 滾管觀察在熒光顯微鏡下觀察看其是否有藍綠色熒光在熒光顯微鏡下標記產甲烷菌菌落，在厭氧操作箱中挑取菌落。菌種保存菌種保存 進行沼氣發酵試驗看其是否產生沼氣4:1的H2/CO2 ，放置在4保存用懸浮液冷凍保存法保藏產甲烷菌METHANOGENEuryarchaeota13微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展原位雜交原位雜交菌落雜交菌落雜交Southern Southern 印跡雜交印

9、跡雜交斑點印跡雜交斑點印跡雜交狹線印跡雜交狹線印跡雜交熒光原位雜交熒光原位雜交核酸探針雜交技術 復性復性RNADNA利用能與特定核苷酸序列發生特異性互補的已知核苷酸片段作探針；探針可以是長探針(100 1000 bp)，也可以是短的寡核苷酸(10 50 bp)。根據所用的探針和靶核酸的不同，雜交可分為DNA-DNA 雜交，DNA-RNA (核糖核酸)雜交，RNA RNA雜交3類METHANOGENEuryarchaeota14微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展核酸探針雜交技術 熒光原位雜交熒光原位雜交p能快速，能靈敏地探測出環境微生物中特殊的核酸序列p定性、定量分析微生物的存在、分布

10、、豐度和適應性等熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是目前單個細胞水平上分析微生物群落結構的常用分子生態學方法。用熒光標記探針，原位鑒定單個細胞, 可原位分析它們的空間及數量分布。METHANOGENEuryarchaeota15微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展PCR-DEEG變性梯度凝膠(DGGE)和溫度梯度凝膠(TGGE)：在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE) ，從正極到負極梯度遞加，或是形成溫度梯度(TGGE )。電泳中的DNA到達它的變性甲酰胺濃度或溫度時，雙鏈部分解開，造成泳動速度發生變化，從而達到分離效果。而且染

11、色后的凝膠用成像系統分析。 PCR-DEEG可以半定量地測定樣品DNA濃度的大小，反映微生物群落組成的變化。METHANOGENEuryarchaeota16微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展PCR-DEEG16S rRNA的基因是細菌的系統分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類少，含量大(約占細菌RNA含量的80)，分子大小適中，存在于所有的生物中 ，既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列，故而被普遍用來菌種分析與鑒定過程中。METHANOGENEuryarchaeota17微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展RFLP分析7.6kb13kb物種物

12、種II物種物種IHap7.6kb13kbSouthernSouthern印跡雜交印跡雜交 I 雜合子雜合子 II分子探針分子探針DNA剪輯序列基因點突變、易位、倒位、缺失和轉座等產生的改變會導致限制性內切酶(RE)的識別位點發生變化，進而使得部分具有同源序列的限制性片段大小發生變化，并在凝膠電泳中表現為不同的電泳遷移率。對每個DNA、RE組合來說，所產生的片段是特異的。METHANOGENEuryarchaeota18微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展RFLP分析設計適當的擴增引物，使擴增片段包括某一個或數個限制性內切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產物；應用特定的核酸

13、內切限制酶切割有關的DNA 分子，經過電泳，原位轉膜印跡，探針雜交，放射性自顯影后，分析與探針互補的DNA 片段在長度上的簡單變化。它可以在群落水平上提供幾乎無窮盡的、反映基因型多樣性的可靠證據，可作為一種能高度靈敏檢測污染環境下微生物種群變化的方法。由于由于16S rDNA的限制性片段長度多態性的限制性片段長度多態性(RFLP)分析分析(ARDRA)所產生的片段多，分所產生的片段多，分析起來工作量大。人們又在此基礎上發展了一種高效、靈敏的方法末端標記限制性析起來工作量大。人們又在此基礎上發展了一種高效、靈敏的方法末端標記限制性片段長度多態性分析片段長度多態性分析(T-RFLPs )。該方法在

14、用通用引物。該方法在用通用引物PCR擴增擴增16SrDNA時，在其時，在其中一條引物的中一條引物的5末端用熒光素進行標記，對標記了的末端片段進行多態性分析。這末端用熒光素進行標記，對標記了的末端片段進行多態性分析。這種方法有效而快速。種方法有效而快速。METHANOGENEuryarchaeota19RAPD分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標記引物熒光標記引物PCR-SSCP實時熒光定量PCR利用隨機引物對目的基因組DNA進行PCR擴增，產物經電泳分離后顯色，分析擴增產物DNA片段的多態性，此即反應了基因組相應片段由于堿基發生缺失、插入、突變、重排等所引發的DNA多態性。D

15、NA 的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構象不同（單鏈構象多態性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。微生物群落研究方法進展微生物群落研究方法進展METHANOGENEuryarchaeota20菌株的系統分類學分析方法菌株的系統分類學分析方法產甲烷菌16S rDNA序列分析：由于16S rDNA序列的保守性及物種之間的差別性，產甲烷菌目前系統分類的主要依據為16S rDNA序列的分析。16S rDNA序列的分析分為以下幾個過程：DNA的制備的制備16S rDNA序列的擴增序列的擴增擴增片段擴增片段的純化的純化制備感受態大腸桿菌制備感受態大腸

16、桿菌擴增片段擴增片段的轉化的轉化質粒質粒DNA的提取的提取測序及結果分析測序及結果分析METHANOGENEuryarchaeota21產甲烷菌的基因組特征產甲烷菌的基因組特征產甲烷菌基因組大小一般介于1.61065.7106 bp之間甲烷桿菌目、甲烷球菌目和甲烷火菌目的基因組均為1.7106 bp左右。甲烷八疊球菌目的基因組大小有較大差異，長度在3.4106 bp、5.7106 bp，也有的基因組大小僅為2.2106 bp。甲烷微菌目和甲烷胞菌目的基因組大小在2.81063.5106 bp之間。產甲烷菌的基因組一般由一條環狀染色體組成,也有一些產甲烷菌除了含一條染色體之外，還存在環狀染色體外

17、元件ECE，而且染色體和ECE 的GC 含量有較大差別產甲烷菌基因組的GC 含量在30%65%之間，這與產甲烷菌所生存的環境有密切的關系，產甲烷菌生長所處的環境溫度越高，一般GC 含量也越高。值得注意的是，甲烷球菌目的菌株GC 含量均較低，基本介于30%35%METHANOGENEuryarchaeota22產甲烷菌的基因組特征產甲烷菌的基因組特征目Order科Family種Genus基因組(bp)Genome (bp)G+C (%)基因Gene閱讀框ORF登錄號Number甲烷桿菌目Methanobacteriales甲烷桿菌科Methanobacteriaceae熱自養甲烷熱桿菌Metha

18、nothermobacter thermautotrophicus str. Delta H1 751 37749.51 9211 873NC_000916馬堡甲烷熱桿菌Methanothermobacter marburgensis str. Marburg1 639 13548.61 8061 757NC_014408甲烷球菌目Methanococcales甲烷球菌科Methanococcaceae詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii DSM26611 739 93331.31 8231 771NC_000909海沼甲烷球菌Methanococcus maripal

19、udis C51 780 761331 8891 822NC_009135海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis C61 744 19333.41 8881 826NC_009975海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis C71 772 69433.31 8551 788NC_009637海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis S21 661 13733.11 7721 722NC_005791海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis X11 746 69732.91 8901 848NC_01584

20、7甲烷火菌目Methanopyrales甲烷火菌科Methanopyraceae坎氏甲烷火菌Methanopyrus kandleri AV191 694 96961.21 7291 687NC_003551甲烷八疊球菌目Methanosarcinales甲烷八疊球菌科Methanosarcinaceae噬乙酸甲烷八疊球菌Methanosarcina acetivorans C2A5 751 49242.74 7214 540NC_003552馬澤氏甲烷八疊球菌Methanosarcina mazei Go14 096 34541.53 4343 368NC_003901馬澤氏甲烷八疊球菌Me

21、thanosarcina mazei Tuc013 427 94942.53 4443 252NC_020389調查甲烷鹽菌Methanohalobium evestigatum Z-73032 242 31736.42 4372 254NC_014253甲烷鬃毛狀菌科Methanosaetaceae理事會甲烷鬃毛狀菌Methanosaeta concilii GP63 026 645512 9272 850NC_015416甲烷微菌目Methanomicrobiales甲烷微菌科Methanomicrobiaceae居泥甲烷盤菌Methanoplanus limicola DSM 22793

22、 200 94642.23 1292 942NZ_CM001436甲烷規則菌科Methanoregulaceae甲酸甲烷規則菌Methanoregula formicicum SMSP2 828 85855.22 9242 816NC_019943甲烷螺菌科Methanospirillaceae亨氏甲烷螺菌Methanospirillum hungatei JF-13 544 73845.13 2943 131NC_00779617甲烷胞菌目Methanocellales甲烷胞菌科Methanocellaceae稻田甲烷胞菌Methanocella arvoryzae MRE503 179 9

23、1654.63 1703 089NC_009464METHANOGENEuryarchaeota23產甲烷菌的基因組特征產甲烷菌的基因組特征圖 3 基于多基因組序列比對生成的產甲烷菌進化樹 METHANOGENEuryarchaeota24產甲烷菌群落結構的演替產甲烷菌群落結構的演替克隆編號系統類群在文庫中包含的克隆數占文庫總克隆的比例(%)Y1-2Methanomicrobium mobile1211.01Y1-4Methanocorpusculum bavaricum1211.01Y1-25Mbr. Ruminantium2220.18Y2-9Methanospirillum hungat

24、ei1514.15Y4-9Uncultured rumen methanogen1412.84F3-5Methanosarcina barkeri2820.37F3-99Methanocorpusculum bavaricum2119.44F3-112Methanobacterium bryantii65.56F4-17Methanococcus vannielii76.48S1-9Methanocorpusculum parvum2118.42S1-13Methanobacterium bryantii1210.53S3-3Methanosarcina barkeri2723.68T1-2M

25、ethanosarcina barkeri1514.15T2-3Methanocorpusculum bavaricum1514.15W2-7Methanosaeta concilii2825.93W2-13Methanobacterium bryantii2926.85W3-15Methanoculleus bourgensis2220.37W4-45Methanocorpusculum parvum2321.30沼氣發酵過程中主要類群分布頻率 METHANOGENEuryarchaeota251 彭喜曦, 張明青, 不產甲烷菌低溫降解秸稈糞便試驗研究 J. 環境科學與管理, 2012, 3

26、7(1): 57-60. 2 崔曉光, 沼氣池中產甲烷菌的分離鑒定及其分布的研究 D. 大連理工大學, 2007. 3 B.K. Ince, O. Ince, G.K. Anderson, et al., Assessment of biogas use as an energy source from anaerobic digestion of brewery wastewater J. Water Air Soil Pollut., 2001, 126(3-4): 239-251. 4 李美群, 鄧潔紅, 熊興耀, 等, 產甲烷菌的研究進展 J. 釀酒科技, 2009, (5): 90-

27、93. 5 呂映輝, 提高產甲烷菌活性的應用研究 D. 山東輕工業學院, 2007. 6 R.E. Hungate, THE ANAEROBIC MESOPHILIC CELLULOLYTIC BACTERIA J. Bacteriological Reviews, 1950, 14(1): 1-49. 7 T.C. Stadtman, H.A. Barker, studies on the methane fermentation X: A new formate decomposing bacterium, methanococcus vannielii J. J. Bacteriol., 1951, 62(3): 269-280. 8 P.H. Smith, R.E. Hungate, ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF METHANOBACTERIUM-RUMINANTIUM N-SP J. J. Bacteriol.