1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟等1、 培養(yǎng)基母液的配制2、 培養(yǎng)基的配制（包括滅菌、包裹）3、 外植體滅菌及接種4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察與分析5、 繼代培養(yǎng)基配制6、 繼代培養(yǎng)7、 誘導(dǎo)發(fā)芽8、 誘導(dǎo)生根9、 馴化移栽10、 收獲及鑒定培養(yǎng)基母液配置（9-25）1. 清洗器皿（初次使用注意事項(xiàng)）并晾干。2. 配置N6培養(yǎng)基等母液（每種母液體積100ml）3. 培養(yǎng)皿（每人至少一個(gè)）清洗、晾干、報(bào)紙包裹、線繩捆扎、滅菌烘干4. 蒸餾水滅菌天平的用法：水平調(diào)節(jié)；稱重時(shí)需要關(guān)好天平所有玻璃窗。藥品內(nèi)部的塑料蓋，記得蓋上，如果不明，擦拭干凈再蓋上。定容：先稱2/3體積水，然后順序加試劑，前一試劑溶解

2、后，加另一試劑，最后用滴定瓶定容。值日：清潔桌面、地面；所有物品使用后歸位（天平蓋上罩子）；座椅歸位；不遲到早退，需要的克數(shù)=（0.166g/147g）*165g （含結(jié)晶水多少）摩爾濃度=0.166/147=x/165N6培養(yǎng)基母液1）大量營養(yǎng)元素（本次配制10X，母液I，每組都做，每個(gè)培養(yǎng)皿可盛放培養(yǎng)基30毫升（25-35ml），一個(gè)100毫升三角瓶可用于3個(gè)培養(yǎng)皿）：本次實(shí)驗(yàn)做100ml 10x （稀釋后可制成1升培養(yǎng)基，可用于33個(gè)培養(yǎng)皿）KNO32.830gCaCl2·2H2O0.166g MgSO4·7H2O0.135gKH2PO40.400g(NH4)2SO4

3、0.463g注：配制時(shí)按表中所列順序逐一添加，每種成分溶解后再溶解另外一種成分。1） B5微量母液：(母液II，第一組)1000ml (100X倍)含KI0.0750gH3BO30.3000gMnSO4·H2O1.0000gZnSO4·7H2O0. 2000gNa2MoO4·2H2O0.0250gCuSO4·5H2O0.0025gCoCl2·6H2O0.0025g注：本次實(shí)驗(yàn)各試劑用量過少，精確度不夠，可全班做100ml。天平用萬分之一天平（十教649）。稀釋后可供100升培養(yǎng)基配制2） B5有機(jī)母液（每種試劑，單獨(dú)一個(gè)試管盛放，）：(母液II

4、I濃度，第二組，用于30個(gè)培養(yǎng)基的制作）煙酸（VB3，Nicotinic acid，單獨(dú)試管盛放）0.001g/ml（每班0.002g，加入2ml蒸餾水，可制作60個(gè)培養(yǎng)基）（100毫升培養(yǎng)基需要0.1毫升，）鹽酸吡哆醇(VB6，單獨(dú)試管盛放) 0.001g/ml（每班0.002g，加入2ml蒸餾水，可制作60個(gè)培養(yǎng)基）（100毫升培養(yǎng)基需要0.1毫升）鹽酸硫胺素(VB1，單獨(dú)試管盛放) 0.010 g/ml（每班0.002g，加入2ml蒸餾水，可制作60個(gè)培養(yǎng)基）（100毫升培養(yǎng)基需要0.1毫升）肌醇(myo-Inositol，單獨(dú)試管盛放) 0.010 g/ml（每班稱取0.2g，加入20

5、ml蒸餾水, 可制作60個(gè)培養(yǎng)基）4)鐵鹽：(母液IV，第三組)本次實(shí)驗(yàn)做：100ml (100X倍)FeSO4·7H2O0.278gNa2EDTA·2H2O0.373g注：配制順序如下1. 稱取0.278g FeSO4·7H2O溶解于20ml去離子水中（A）。2. 稱取0.373g Na2-EDTA·2H2O溶解于20 ml去離子水中（B）。3. 將A置于70水浴鍋中直至溶質(zhì)完全溶解（C）。4. 將A倒入C中混合，置于70水浴鍋中保溫2h（小時(shí)）。5. 定容至100ml。5）激素（第四組）激素溶解方法母液濃度6-BA加稀堿溶解（1M NaOH），再用蒸

6、餾水定容1 mg/mlNAA加堿溶解（1M NaOH），再用蒸餾水定容1 mg/ml2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸餾水定容（每班稱取0.0050g，加入 20毫升蒸餾水，可配置60個(gè)培養(yǎng)皿）0.00025 mg/ml培養(yǎng)基配置及滅菌（10-13）移液器的使用實(shí)驗(yàn)步驟：1 滅菌，晾涼：培養(yǎng)皿、蒸餾水（開、關(guān)蓋子）后，培養(yǎng)皿烘干。2 （2-3小時(shí)）培養(yǎng)基配制：母液稱量、添加瓊脂、調(diào)節(jié)pH、導(dǎo)入三角瓶（100ml培養(yǎng)基），滅菌，涼到50-60度左右，搖勻，分別注入培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿的一半，要厚，提供營養(yǎng)，一半3個(gè)培養(yǎng)皿需要100ml）3 超凈臺(tái)風(fēng)干后，保鮮膜包裝，放入4度冰箱，可挑選一培養(yǎng)皿（包好）放

7、于28度，進(jìn)行污染觀察。準(zhǔn)備的藥品（）（第一組）2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸餾水定容0.25 mg/ml 10ml（第三組）1N NaOH（14N 4g溶于100 ml水中）（第三組）1N HCl（14N 8.3 ml溶于91.7 ml水中）（第一組）70%酒精（70 ml酒精溶于30 ml水）（一）培養(yǎng)基配方每3個(gè)培養(yǎng)基配100毫升培養(yǎng)液，分別放到三角瓶里，滅菌后，報(bào)紙封口，每100毫升含有：母液I ：N6大量元素（10x，）：10ml母液II（B5微量）：1ml鐵鹽：1ml煙 酸：0.1 ml鹽酸吡哆醇：0.1 ml鹽酸硫胺素：0.1 ml肌 醇：1mlL-proline脯氨酸: 0.

8、28g蔗糖：3gCH （Casein acid hydrolysate）絡(luò)氨酸:0.03g2,4-D :1mlPhytagel:0.7g（1g的瓊脂條）PH值：58（6）（二）培養(yǎng)基配置（1）在配置培養(yǎng)基時(shí)取適量(配置培養(yǎng)基總量的2/3左右)的蒸餾水放入容器內(nèi)。（2）把容器放在電磁爐或者水浴鍋上加熱，同時(shí)加入剪斷的瓊脂條。 （3）不停攪拌，防止粘鍋，同時(shí)加速溶解。 （4）按量稱取蔗糖并加入，同時(shí)攪拌。（5）待瓊脂條、蔗糖完全溶解后加入母液（N6大量元素）、母液（B5微量元素）（80左右），然后攪拌均勻。 （6）加入鐵鹽母液IV。（7）待培養(yǎng)基冷卻至50-60時(shí)加入有機(jī)成分，到培養(yǎng)基達(dá)到40時(shí)加

9、入激素(2,4-D)。（8）加入蒸餾水定容到量(按照10個(gè)培養(yǎng)基計(jì)算，300 ml)，測(cè)定pH值，用0.1mol/L NaOH 或HCL 將培養(yǎng)基的pH調(diào)至所需數(shù)值（PH=6.0左右）。 （9）清洗培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)蓋，瀝干水份。 （10）用分裝器將培養(yǎng)基分裝到三角瓶(1L 不用分裝)中，趁熱分裝。分裝時(shí)注意不要將培養(yǎng)基濺到容器壁口，以免引起污染。分裝量根據(jù)培養(yǎng)材料不同而異，每瓶裝入100ml（250ml三角瓶）。 11）選用合適的封口材料包扎好瓶口或蓋上瓶蓋。 12）在培養(yǎng)基瓶上貼上標(biāo)簽或用記號(hào)筆在瓶壁上注明培養(yǎng)基的代號(hào)、配制時(shí)間等，以免混淆。然后用塑料周轉(zhuǎn)筐運(yùn)至滅菌室準(zhǔn)備滅菌。 13）同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)

10、時(shí)所需要的解剖刀、解剖針、紗布、鑷子、無菌水燈放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌。（滅菌步驟附后）14）超凈臺(tái)酒精擦拭，開uv，風(fēng)，放入滅好菌的三角瓶和培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。15）培養(yǎng)基冷卻、風(fēng)干后，包好放入4度冰箱備用。（三）高壓滅菌操作步驟 1）首先將內(nèi)層滅菌桶取出,再向外層鍋內(nèi)加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。 2）放回滅菌桶,并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠,以免蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸,以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。 3）加蓋,并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓,使螺栓松緊一致,勿使漏氣。 4）

11、加熱,并同時(shí)打開排氣閥,使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后,關(guān)上排氣閥,讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí),控制熱源,維持壓力至所需時(shí)間（121攝氏度/15-20分鐘）。5）滅菌所需時(shí)間到后,讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降,當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí),打開排氣閥,旋松螺栓,打開蓋子,取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí),打開排氣閥,就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降,使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口,造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染注意：1、鍋內(nèi)加的水一定要為去離子水， 以避免鍋底水垢產(chǎn)生。2、鍋內(nèi)的水一定要沒過底部平板，以防甘燒。3、每次滅菌之前都要檢查滅菌的時(shí)

12、間溫度設(shè)置。4滅菌完畢壓力未降至0時(shí)，千萬不要隨意打開頂蓋。（四）超凈工作臺(tái)1.實(shí)驗(yàn)前將紫外燈開啟20min以上。2.用棉球蘸取70%酒精將超凈工作臺(tái)整個(gè)空間擦拭一遍。3.進(jìn)行無菌操作時(shí)，動(dòng)作盡量輕柔，時(shí)刻保持無菌意識(shí)。4.冷卻至50-60度的培養(yǎng)基導(dǎo)入預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿（20-30ml）中。5.培養(yǎng)基過夜風(fēng)干后，保鮮膜包裹，4度冰箱備用（五）無菌室無菌室應(yīng)定期（每星期）用70酒精或84消毒液消毒，配合紫外線滅菌燈每次開啟20分鐘以上，以使無菌室經(jīng)常保持高度的無菌狀態(tài)。外植體滅菌與接種（10-13）準(zhǔn)備物品：酒精燈，1 （3小時(shí)）提前滅菌：50ml離心管、蒸餾水(500ml 廣口瓶放入800m

13、l水)、濾紙(錫箔紙包裹)等2 提前準(zhǔn)備：種子去殼、70%酒精，次氯酸鈉，錫箔紙，酒精燈、鑷子、支架等3 （3小時(shí)）種子消毒：70%酒精，次氯酸鈉，滅菌水清洗、種子放于濾紙上晾干。4 （1小時(shí)）接種：用鑷子（每次夾取種子前火焰灼燒）溶液配制30%次氯酸鈉溶液：V NaClO：VH2O=1：270%酒精：稀釋100%或95%的乙醇至70%水稻（日本晴）愈傷組織的誘導(dǎo)（以水稻成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織）1 消毒：取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒：1） 蒸餾水清洗2） 將種子放入30ml無菌50ml離心管中，倒入70%酒精消毒1分鐘；2）倒去酒精，加入30ml

14、 30%次氯酸鈉（NaClO）溶液（5.2%次氯酸鈉），浸泡30分鐘； 3) 倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍（每次10分鐘），最后一遍浸泡30分鐘。 2誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）種子放在無菌濾紙上吸干，置成熟胚于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿12額外1014顆；3） 操作完畢用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培養(yǎng)皿，在30光照培養(yǎng)箱，4） 培養(yǎng)4周；5） 在超凈工作臺(tái)上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然散落的胚性愈傷組織（淡黃色，致密呈球狀），在30光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1-2周。(沒有脫落的可在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7天，次數(shù)多了效果會(huì)減弱)實(shí)驗(yàn)四：愈

15、傷組織繼代培養(yǎng)每0.1升可以配制3-4個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基：N6大量元素（10X）：10mlB5微量（100X）：1ml鐵 鹽（100x）：1ml煙 酸：0.1 ml鹽酸吡哆醇：0.1 ml鹽酸硫胺素：0.1 ml肌 醇：1mlL-Glu L-Glutamine：0.05 gL-pro:0.28gCH :0.03g2,4-D0.8ml蔗 糖3gPhytagel:0.40g（瓊脂條1g）PH值：58粳稻成熟胚愈傷組織繼代培養(yǎng)基（每升含量）：N6大量元素（20x）：50mlB5微量(100x)：10ml鐵 鹽(100x)：10ml煙 酸：1 ml鹽酸吡哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10ml

16、L-Glu L-Glutamine：0.5 gL-pro:2.8gCH :0.3g2,4-D8ml蔗 糖30gPhytagel:4.0gPH值：58實(shí)驗(yàn)六：誘導(dǎo)長芽（14）挑取顏色鮮黃的抗性愈傷移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或分化罐中，用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗（30-60天）。苗長至1cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗。注：分化過程中不可將愈傷繼代培養(yǎng)。以上操作步驟皆在無菌條件下進(jìn)行。粳稻分化培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量元素：50mlB5微量：10ml鐵 鹽：10ml煙 酸：1 ml鹽酸吡哆醇：1 ml鹽酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5

17、 gCH :0.3g6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗 糖：30gAgar 8 gPH值： 58實(shí)驗(yàn)七：誘導(dǎo)生根（15）6） 粳稻生根培養(yǎng)基配方（每升含量）：N6大量元素：25mlB5微量：5ml鐵鹽：5ml煙 酸：0.5ml鹽酸吡哆醇：0.5 ml鹽酸硫胺素：0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar: 8.0gpH5.8實(shí)驗(yàn)八：移栽馴化（16）鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽時(shí)間大約為三個(gè)月左右。將根部和莖葉分化得較完好的苗從試管挑出（苗長至試管頂部，就要及時(shí)開蓋），打開封口膜，加入適量無菌水（防止培養(yǎng)基長菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測(cè)。水稻苗

18、期水培營養(yǎng)液配方：Macro-nutrient solution (mM)元素終濃度使用鹽類分子量(g/mol)母液(103)用量(g/L)N2.5(1.25 mM)NH4NO380.04100P0.3KH2PO4136.0940.83K1(0.35mM)K2SO417460.9Ca1CaCl2·2H2O147147Mg1MgSO4·7H2O246.5246.5SiO20.5Na2SiO3·9H2O284.2142.1Micro-nutrient solution (µM) Mn9MnCl2·4H2O197.921.781Mo0.39Na2MoO4·2H2O241.950.0944B20H3BO361.831.2366Zn0.77ZnSO4·7H2O287.560.2214Cu0.32CuSO4·5H2O249.680.0799Fe20FeSO4·7H2O+Na2_EDTA278.025.57注: 2 制備大量元素營養(yǎng)液母液時(shí)，各種鹽類分別溶解，分別儲(chǔ)存，使用時(shí)每升營養(yǎng)液加1mL母液。3 制備微量元素營養(yǎng)液（除Fe外）