1、紫外可見分光光度法光的吸收定律一. Lambert-Beer 定律光吸收基本定律“ Lambert-Beer 定律 ” 是說明物質對單色光吸收的強弱與吸光物質的濃度（c）和 液層厚度 （b）間的關系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可見光度法定量的基礎。Lambert定律 吸收與液層厚度 （b）間的關系Beer 定律 吸收與物質的濃度（c）間的關系“ Lambert-Beer 定律 ”可簡述如下：當一束平行的單色光通過含有均勻的吸光物質的吸收池（或氣體、固體）時，光的一部分被溶液吸收，一部分透過溶液，一部分被吸收池表面反射；設：入射光強度為 Io，吸收光強度為Ia，透過光強度為It，反射光強

2、度為Ir，則它們之間的關系應為：  Io = Ia + It + Ir          (4)若 吸收池的質量和厚度都相同，則 Ir 基本不變，在具體測定操作時 Ir 的影響可互相抵消（與吸光物質的 c及 b 無關）上式可簡化為：           Io= Ia + It               (5)實驗證明：當一束強度為 I0

3、 的單色光通過濃度為 c、液層厚度為 b 的溶液時，一部分光被溶液中的吸光物質吸收后透過光的強度為  It ，則  它們之間的關系為：稱為透光率，用 T % 表示。稱為 吸光度，用 A 表示則                A = -lgT = K · b ·c                    

4、0; (7)此即    Lambert-Beer  定律  數學表達式。 L-B 定律 可表述為：當一束平行的單色光通過溶液時，溶液的吸光度 (A) 與溶液的濃度 (C) 和厚度 (b) 的乘積成正比。它是分光光度法定量分析的依據。二. 吸光度的加和性設 某一波長（ l ）的輻射通過幾個相同厚度的不同溶液c1，c2. cn，其透射光強度分別為 I1， I2 . In，根據吸光度定義：這一吸光體系的總吸光度為而 各溶液的吸光度分別為：吸光度的和為：即  幾個（同厚度）溶液的吸光

5、度等于各分層吸光度之和。如果溶液中同時含有 n 中吸光物質，只要各組分之間無相互作用（不因共存而改變本身的吸光特性），則：A = K1C1 b1 + K2C2 b2 +  KnCn bn = A1 + A2+ + An     (10)應用：進行光度分析時，試劑或溶劑有吸收，則可由所測的總吸光度 A 中扣除，即 以試劑或溶劑為空白的依據；      測定多組分混合物； 

6、;     校正干擾。三. 吸光系數Lambert-Beer  定律中的比例系數“K ”的物理意義是：吸光物質在單位濃度、單位厚度時的吸光度。一定條件（T、 l 及溶劑）下， K 是物質的特征常數，是定性的依據。K 在標準曲線上為斜率，是定量的依據。常有兩種表示方法：1. 摩爾吸光系數（e）：當 c用 mol/L 、b 用 cm 為單位時，用摩爾吸光系數 e  表示，單位為 L/mol·cm    

7、;                A = e · b · c                        (11)e 與 b及 c 無關。e 一般不超過 105 數量級，通常： e  > 10

8、4 為強吸收；e < 102 為弱吸收；102 > e  > 104 為中強吸收。吸收系數不可能直接用 1 mol/L 濃度的吸光物質測量，一般是由較稀溶液的吸光系數換算得到。2. 吸光系數當 c 用 g /L ，b 用 cm 為單位時，K 用吸光系數 a 表示，單位為 L/g·cm                    

9、0;A = a · b · c                      (12)e 與 a 之間的關系為：    e = M · a                   

10、60;  (13)e 通常多用于研究分子結構a 多用于測定含量。四. 引起偏離 Lambert-Beer  定律的因素根據 L-B  定律，A與c的關系應是一條通過原點的直線，稱為“標準曲線”。但事實上往往容易發生偏離直線的現象而引起誤差，尤其是在高濃度時。導致偏離L-B定律的因素主要有：1. 吸收定律本身的局限性事實上， L-B  定律是一個有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。由于在高濃度時（通常 C > 0.01mol/L），吸收質點之間的平均距離縮小到一

11、定程度，鄰近質點彼此的電荷分布都會相互受到影響，此影響能改變它們對特定輻射的吸收能力，相互影響程度取決于C，因此，此現象可導致 A與 C 線性關系發生偏差。此外，    （ n 為折射率）只有當 c &pound; 0.01mol/L（低濃度）時，n 基本不變，才能用e 代替e真 。2. 化學因素     溶液中的溶質可因 c 的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發生偏離&

12、#160;L-B 定律的現象。例：在水溶液中，Cr()的兩種離子存在如下平衡Cr2O42- + H2O 2CrO42- + 2H+Cr2O42- 、CrO42-  有不同的 A 值，溶液的 A  值是二種離子的 A 之和。但由于隨著濃度的改變（稀釋）或改變溶液的 pH 值， Cr2O42- /CrO42- 會發生變化，使C總與 A總 的關系偏離直線。消除方法：控制條件。3. 儀器因素（非單色光的影響）L-B 定律的重要前提是“單色光”，即 只有一

13、種波長的光；實際上，真正的單色光卻難以得到。由于吸光物質對不同 l 的光的吸收能力不同（ e 不同），就導致對的偏離。“單色光”僅是一種理想情況，即使用棱鏡或光柵等所得到的“單色光”實際上是有一定波長范圍的光譜帶，“單色光”的純度與狹逢寬度有關，狹縫越窄，他所包含的波長范圍也越窄。4. 其它光學因素（1）散射和反射：渾濁溶液由于散射光和反射光而偏離 L-B（2）非平行光紫外可見分光光度法光度法顯色反應條件和測量條件的選擇一. 影響顯色反應的因素及反應條件的選擇（一）顯色反應的選擇1. 選擇性好：干擾少或易排除；2. 靈敏度高（S）：尤其是對低含量組分，一般選擇 e

14、：104 105 L/mol·cm3. 有色化合物穩定、組成恒定4. 有色化合物與顯色劑的顏色差別大（二）影響顯色反應的因素及反應條件1. 顯色劑的用量M + R MR待測組分 顯色劑 有色化合物在被測組分一定及其它實驗條件不變的情況下，分別測得加入不同量顯色劑測得A值，作A-cR曲線，常見以下二種情況：圖7 吸光度與顯色劑加入量的關系(a)在 a 與 b之間任選一點吸光度與顯色劑加入量的關系(b)嚴格控制CR因此，合適的 cR 通過實驗確定。2. 溶液的酸度(1) 對金屬離子存在狀態的影響防止水解，防止沉淀生成(2) 對顯色劑濃度的

15、影響 H2R 2H+ + R2-(3) 對顯色劑顏色的影響pKa pKaH2R H+ + HR- 2H+ + R2-        6.9       12.4黃      橙         紅適宜的pH 通過實驗確定：做 A-pH曲線（其它條件并不變），從中找出 A 較大且基本不變的某pH范圍。3. 顯色時間：各種顯色反應得速度不同，反應完全所

16、需時間不同；有些有色化合物在一定的時間內穩定。選擇方法：作 A-t（min）曲線，選擇在 A 較大且穩定的時間內進行。4. 顯色溫度：顯色反應一般在室溫下進行，但反應速度太慢或常溫下不易進行的顯色反應需要升溫或降溫。選擇方法：作 A-T （）曲線，選擇在 A 較大的時間內進行。5. 溶劑：實驗確定選擇合適的溶劑（常為有機溶劑），提高反應的靈敏度及加快反應速度。二. 分光光度法測量誤差及實驗條件的選擇（一）測量誤差及 A 范圍的選擇任何一臺分光光度計都有光度誤差 T%，但給定的一臺分光光度計， T 基本上是一常數，一

17、般為 ±0.002 ± 0.01，但在不同 T 時同樣的 T 對應的 A 則不同，所以引起的C/C (濃度的相對誤差)就不同。由 L-B 定律得：          (20)                  將此式微分得：濃度相對誤差為：           

18、;      (21)設 當 T = ± 0.01時 ，不同 T% 時所對應的 c/c 可從相關表查得：當 T% = 36.8% 即 A = 0.434時， c/c 最小；當 T% 在 15-65% 之間即 A 在0.2 0.8范圍內，c/c 較小。實際測定時：可通過控制溶液的 c 及 b 使 A 在 0.2 0.8 范圍內。（二）測量波長選擇一般

19、根據吸收光譜選擇 lmax測定靈敏度高、A 隨波長變化小若有干擾，根據“吸收大，干擾小”原則選擇l 。如：3，3-二氨基聯苯（DAB）和 Se 形成配合物 Se-DAB 的最大吸收波長在340nm波長處，DAB也有很強的吸收，在這種情況下，分析波長應選用次大吸收波長420nm，否則測量誤差較大。3. 狹縫寬度理論上，定性分析采用最小的狹縫寬度，在定量分析中，為避免狹縫太小，出射光太弱而引起信噪比降低，可以將狹縫開大一點。通過測定 A 隨狹縫寬度的變化規律，可選擇出合適的狹縫寬度。狹縫寬度在某個范圍內，A 值恒定，狹縫寬度增大至一定程度

20、時 A 減小，因此：合適的狹縫寬度是在 吸光度不減小時的最大狹縫寬度。（三）空白溶液的選擇空白溶液是用來調節工作零點 即 A=0，T%=100% 的溶液，以消除溶液中其它基體組分以及吸收池和溶劑對入射光的反射和吸收所帶來的誤差。根據情況不同，常用空白溶液有如下選擇：1. 溶劑空白：當溶液中只有待測組分在測定波長下有吸收，而其它組分無吸收時 用純溶劑作空白；2. 試劑空白：如果顯色劑或其它試劑有吸收，而待測試樣溶液無吸收 則用不加待測組分的其它試劑作空白；3. 試樣空白：如果試樣基體有吸收，而顯色劑或其它試劑無吸收 則用不加顯色劑的試樣溶液作空白；4. 平行操作空白

21、：用溶劑代替試樣溶液，以與試樣完全相同的分析步驟進行平行操作，用所得的溶液作空白。紫外可見分光光度法定性及定量分析方法一. 定性分析    選擇合適的溶劑（非極性），使用有足夠純度單色光的分光光度計，在相同的條件下測定相近濃度的待測試樣和標準品的溶液的吸收光譜，然后比較二者吸收光譜特征：吸收峰數目及位置、吸收谷及肩峰所在的位置（ l ）等；分子結構相同的化合物應有完全相同的吸收光譜。二. 定量分析（一）單組分定量分析方法1. 標準曲線法：配制一系列（510）個不同c的標準溶液 ，在適當l  通常為 lmax下，以適當的空白溶液作參比，

22、分別測定A，然后作 A-c 曲線同條件下測定試樣溶液吸光度 Ax ，查找對應的 cx 。2. 直接比較法：已知試樣溶液基本組成，配制相同基體、相近濃度的標準溶液，分別測定吸光度A標、A樣根據 L-A 定律： A標 = K · b · c標            A樣 = K · b · c樣則         

23、0;        (18)（二）多組分定量分析    混合組分的吸收光譜相互重疊的情況不同，測定方法也不相同，常見混合組分吸收光譜相干擾情況有以下三種：  圖5  混合組分吸收光譜的三種相干情況示意圖1.第一種情況：各種吸光物質吸收曲線不相互重疊或很少重疊，則可分別在l1 及 l2 處測定 a  及 b 組分的 c；2. 第二種情況  部分重疊：先在 l1

24、 處測得 ca  ,再在 l2 處測得混合組分的吸光度 Aa+b ，根據吸收定律加和性：即可求得cb。應先求得 ea(l2 ) ，與 ea(l2 ) ，并使用相同 b 3. 第三種情況:兩吸收曲線互相重疊，但服從 L-B 定律(1) 解方程組法：若試樣中需要測定兩種組分，則選定兩個波長l1 及 l2 ，測得試液的吸光度為 A1和 A2，則可解方程組求得組分a、b 的濃度ca、c

25、b ：如果混合物含有 n 個組分，可不經分離，在 n 個適當波長處進行 n 次測量，獲得 n個吸光度值，然后解 n 個聯立方程以求得各組分的濃度。（2）等吸光度雙波長（消去）法吸收光譜重疊的 d、e兩組分共存，現設法把一種組分(a)的吸光度消去。方法如下：圖6  二組分混合物吸收光譜用作圖法選擇l1、l2（雙波長分光光度法）選取兩個適當的波長l1 和 l2 ，使 e1d= e2d ，而盡可能大，則用這兩個波長l1 和 

26、;l2測得混合物溶液吸光度之差 A 應只與 ce 成正比（而與cd無關），直接測得ce ：因為             所以     若用 1cm 吸收池    若需測定另一組分 d 時，也可用同樣方法，選擇另一個l1 和 l2 ，先消去的 e 的干擾，直接求cd紫外可見分光光度法分子吸收光譜一. 分子吸收光譜的產生（一）分子能

27、級與電磁波譜    分子中包含有  原子和電子，分子、原子、電子都是運動著的物質，都具有能量，且 都是量子化的。在一定的條件下，分子處于一定的運動狀態，物質分子內部運動狀態有三種形式：電子運動：電子繞原子核作相對運動；原子運動：分子中原子或原子團在其平衡位置上作相對振動；分子轉動：整個分子繞其重心作旋轉運動。  所以：分子的能量總和為               E分子= Ee +Ev +Ej +

28、 (E0 +E平)                (3)    分子中各種不同運動狀態都具有一定的能級。三種能級：電子能級 E（基態 E1與激發態 E2）                    振動能級 V= 0，1，2，3       &

29、#160;             轉動能級 J = 0，1，2，3     當分子吸收一個具有一定能量的光量子時，就有較低的能級基態能級 E1 躍遷到較高的能級及激發態能級 E2 ，被吸收光子的能量必須與分子躍遷前后的能量差E 恰好相等，否則不能被吸收。圖1  雙原子分子的三種能級躍遷示意圖對多數分子           對應

30、光子波長             光      譜E 約為120eV           1.25 0.06    紫外、可見區(電子)E 約為0.51eV             25 1.25           &

31、#160;(中)紅外區 (振動)E約為10-40.05eV        1.25cm 25          （遠）紅外區(轉動)     分子的能級躍遷是分子總能量的改變。當發生電子能級躍遷時，則同時伴隨有振動能級和轉動能級的改變，即 “電子光譜”均改變。     因此，分子的“電子光譜” 是由許多線光譜聚集在一起的帶光譜組成的譜帶，稱為“帶狀光譜”。    由于各種物質分

32、子結構不同 &reg; 對不同能量的光子有選擇性吸收 &reg;  吸收光子后產生的吸收光譜不同 &reg;  利用物質的光譜進行物質分析的依據。二. 紫外-可見吸收光譜與有機分子結構的關系（一）電子躍遷的類型    許多有機化合物能吸收紫外-可見光輻射。有機化合物的紫外-可見吸收光譜主要是由分子中價電子的躍遷而產生的。    分子中的價電子有：           成 鍵 電 子： s 電子、p 電子

33、（軌道上能量低）           未成鍵電子： n 電子（  軌道上能量較低）     這三類電子都可能吸收一定的能量躍遷到能級較高的反鍵軌道上去，見 圖-2：圖2  分子中價電子躍遷示意圖1. s - s* 躍遷   s-s*的能量差大&reg;所需能量高&reg;吸收峰在遠紫外 (l<150nm)    飽和烴只有s 、s* 軌道，只能產生s - s*躍遷，例如：&#

34、160;   甲烷 吸收峰在 125nm；乙烷 吸收峰在 135nm ( < 150nm )  ( 因空氣中O2對< 150nm輻射有吸收，定量分析時要求實驗室有真空條件，要求一般難達到）2. p-p* 躍遷  p-p*能量差較小&reg;所需能量較低&reg;吸收峰紫外區 (l200nm左右)  不飽和烴類分子中有p電子，也有p* 軌道，能產生p-p*躍遷：CH2=CH2 ,吸收峰  165nm。（吸收系數 e 大，吸收強度大，屬于強吸收）3. n- s*躍遷  &

35、#160; n- s* 能量較低 &reg; 收峰紫外區  (l 200nm左右)  （與p-p*接近）    含有雜原子團如：-OH，-NH2 ，-X，-S 等的有機物分子中除能產生s-s* 躍遷外，同時能產生n- s *躍遷，例如：三甲基胺 (CH3)3N- 的 n- s* 吸收峰在 227 nm， e 約為900 L/mol·cm ，屬于中強吸收。4. n- p*躍遷   n- p*能量低 &reg; 吸收峰 在 近紫外、可見區  (

36、l 200 700nm)含有雜原子的不飽和基團，如  -C=O，-C&ordm;N 等，例如：    丙酮： n- p*躍遷， lmax 280nm左右（同時也可產生p-p*躍遷），屬于弱吸收， e < 500 L/mol·cm .    各種躍遷所需能量大小次序為： s - s* > n- s* &sup3; p-p* > n- p*    紫外-可見吸收光譜法在有機化合物中應用主要以：p-p* 、n- p* 為基礎。（二）吸收峰的長移和短移           長移：吸收峰向長 移動的現象，又稱 紅移；