1、蛋白質提取常用試劑及操作方法一、原料選擇和前處理（一）原料的選擇早年為了研究的方便， 盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白質。但至目前經常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。原料的選擇主要依據實驗目的定。從工業生產角度考慮， 注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時這幾方面不同時具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想， 但分離純化操作繁瑣， 反而不如含量略低些易于獲得 純品者。一般要注意種屬的關系，如鯉的心肌細胞色素C較馬的易結晶，馬的血紅蛋白較牛的易結晶。要事前調查制備的難易情況。若利用蛋白質

2、的活性，對原料的種屬應幾乎無影 響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質的活性，用豬或牛胰臟均可。 但若研究蛋白質自身的性質及結構時，原料的來源種屬必須一定。研究由于病態引起的特殊蛋白質（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白）時，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個體的原料?？赡軙r盡量用 全年均可采到的原料。對動物生理狀態間的差異（如饑餓時脂肪和糖類相對減少），采收期及產地等因素也要注意。（二）前處理l. 細胞的破碎材料選定通常要進行處理。要剔除結締組織及脂肪組織。如不能立即進行實驗，則應冷 凍保存。除了提取及胞細外成分，對細胞內及多細胞生物組織中的蛋白質的分離提取均須先 將細胞破碎，使其充分釋放到溶液中。

3、 不同生物體或同一生物體不同的組織，其細胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即 可，肌肉及心組織較韌，需預先絞碎再制成勻槳。 機械方法主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。常用器械有：高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），宜用于動物內臟組織的破碎；玻璃勻漿器（用兩 個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質塑料等，兩面間 隔只有十分之幾毫米， 對細胞破碎程度較高速搗碎機高，機械切力對分子破壞較小。 小量的也可用乳缽與適當的緩沖劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。 但在磨細時局部往往

4、生熱導致變性或 pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。磨細劑的吸附也可導致損 失。 物理方法 主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。 I .反復凍融法于冷藏庫或干冰反復于零下1520 C使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結變性。 n.冷熱變替法 將材料投入沸水中，于 90 C左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細 胞被破壞。m.超聲波法暴露于910千周聲波或10500千周超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便且 效果也好

5、，但一次處理量較小。 應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些 超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。IV.加壓破碎法加一定氣壓或水壓也可使細胞破碎?；瘜W及生物化學方法1. 有機溶媒法粉碎后的新鮮材料在 0C以下加入510倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜， 破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙酰洗， 經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性。n.自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當的溫度下，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取愈肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲

6、苯、氯仿等。應防止細菌污染。于溫室30 C左右較早溶化。自體融解過程中PH顯著變化，隨時要調節 pH。自溶溫度選在04C,因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。 m.酶法與前述的自體融法同理， 用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。但值得提出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g菌體加110mg溶菌酶，pH6.27.01h內完全溶菌。于生理食鹽 水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及 纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。 表面活性劑處理：較常用的有十二烷基磺酸

7、鈉、氯化十二烷基毗淀及去氧膽酸鈉等。 此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。2. 細胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來分子生物學、 分子遺傳學、遺傳工程等學科和技術的發展，對分布在各種細胞器上的核酸和蛋白質的研究工作日益 增多，分離各種細胞器上的各類核酸和特異性蛋白質已成為生物大分子制備工作重要內容之一。 各類生物大分子在細胞內的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細胞核內

8、。RNA則大部分分布于細胞質。各種酶在細胞內分布也有一定位置。因此制備細胞器上的生物大分子時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布匹有所了解。以肝細胞為例整理如表1。表1蛋白質、酶及核酸在肝細胞內分布情況 細胞器名稱主要蛋白質及酶類 核酸類 細胞核： 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系RNA占總量10%左右，DNA幾乎全部。粒線體：電子傳遞、氯化磷酸化、三愈酸循環、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、服合成等酶系 RNA占 總量5%左右，DNA微量。 內質網（微粒體）：蛋白質合成酶系、羥化酶系RNA占總量50%左右。溶酶體：水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖昔及糖昔酶等）。高爾基氏體：糖

9、昔轉移酶、粘多糖及類固醇合成酶系。細胞膜：載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP酶、環化腺昔酶、5'-核昔酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶等。 細胞液：嗜嚏和喋吟代謝、氨基酸合成酶系、可溶性蛋白類RNA （主要為tRNA）占總量30%。二、蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化方法很多，主要有：（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法1、蛋白質的鹽析中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸鉉的SO4和NH4）有很強的水化

10、力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之失水”，于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時若溶液 pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程 度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清 蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2） pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地

11、一起沉淀出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸鉉、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸鉉，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為 3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶 都可以鹽析出來；另外硫酸鉉分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。 硫酸鉉溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析， 即把蛋白質溶液裝入

12、秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小， 各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀， 但此法很少單獨使用， 可與鹽析法結合用。3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮， 可使多數蛋白質溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半

13、透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之 一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged ）和瓊脂糖凝膠（agarose gel ）。（三）根據蛋白質帶電性質進行分離蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。1、電泳法各種蛋白質在同一 pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體

14、，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑（如：愈甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體"LANG="ZH-CN"纖維素），當被分離的蛋白質 溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上， 隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）（四）根據配體特異性的分離方法-親和色譜法 親和層

15、析法（aflinity chromatography ）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體（Ligand ）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（ Separation ）,提純（Purification ） 和鑒定（Characterization ）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的 方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出

16、來，因此往往采取幾種方法聯合使用。三、濃縮、干燥及保存（一）樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的， 往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：1、減壓加溫蒸發濃縮通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發 ，鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。3、 冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進

17、入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮于液面， 蛋白質和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。4、 吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀毗咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外 加聚乙二醇復蓋置于 4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新

18、的直至達到所需要的體積。5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方 法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻 保留，這是近年來發展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽， 并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在于膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo超濾膜的分子量截留值：膜名

19、稱分子量截留值孔的大的平均直徑XM- 300300 , 000140XM- 200100, 00055XM- 5050, 00030PM-3030, 00022UM 2020, 00018PM- 1010, 00015UM 21 , 00012UM0550010用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。 當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。（二）干燥生物大分子制備得到產品，為防止變質，易于保

20、存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質的干燥和保存，整個裝置包 括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到 冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優點，適用于各類生物大分子的干燥保存。（三）貯存生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。 干燥的制品一般比較穩定，在低溫情況下 其活性可在數日甚至數年無明顯變化， 貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于干燥器內 （內

21、裝有干燥劑）密封，保持 0-4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質 和酶常用的穩定劑有硫酸鉉糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。 此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸 檬酸鈉的標準緩沖液中。3、 貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。細胞器的分離細胞器的分離一般采用差速離心法。細胞經過破碎后，在適當介質中進行差速離心。利用細胞各組分質量

22、大小不同，沉降于離心管內不同區域， 分離后即得所需組分。 細胞器的分離制備、介質的選擇十分重要。最早使用的介質是生理鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發生聚集作用結成塊狀，沉淀分離效果不理想，現一般改用蔗糖、Ficoll （一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提?。捍蟛糠值鞍踪|均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。 稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，也是提取蛋白質的最常用溶劑。 鹽溶液提?。?以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質進常注意下面幾個因素。1. 鹽濃度等滲鹽溶液尤以 0.020.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L 氯

23、化鈉溶液應用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用 0.1mol/L碳酸氫鈉液提取等。有時為了螯 合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合，也常使用枸椽酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質需用1mol/L以上氯化鈉液提取?？傊?，只要能溶解在水溶液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶，細胞破碎后選擇適當的鹽濃度及 PH, 一般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊 的，需采用有機溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。2. PH 值：蛋白質提取液的PH值首先應保證在蛋白質穩定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。 如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋

24、白質選擇偏堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果。如細胞色素 C屬堿性蛋白質，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提取。某些蛋白質或酶與其分物質結合常以離子鍵形式存在，選擇PH36范圍對于分離提取是有利的。3. 溫度：多數酶的提取溫度在 5C以下。少數對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適當提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇 3750 C條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時加入底物或輔酶，改變酶分子 表面電荷分布，也能促進提取效果。4. 有機溶劑提取：有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。但一些和脂結

25、合較牢或分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。從一些 粒線體(Mitochondria)及微粒體(Microsome)等含多量脂質物質中提取蛋白質時，采用 Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與 水也能溶解10% ,因此具有脂質與水之間的表面活性作用，可占據蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣(pH310,溫度-2C至40 C)。丁醇法對提取堿性磷酸脂酶效果也是十分 顯著的。胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮

26、中。以60 70%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。(1) 表面活性劑的利用：對于某些與脂質結合的蛋白質和酶，也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等 處理。表面活性劑有陰離子型(如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等)，陽離子型(如氧化節烷基二甲基鉉等)及非離子型( Triton X-100 、TirtonX-114、吐溫60及吐溫80)等。 非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對于膜結構上的脂蛋白和結構，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成復合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面

27、活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型表面活性劑。(2) 對提取物的保護：在各種細胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數蛋白水解酶的最適PH在35或更高些，因在較低 PH條件下可降低蛋白質水解酶引起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態，不表現水解活力。加蛋白質水解酶的抑制劑也同樣起保護作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以疏基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機溶劑時也能產生相類似的作用。蛋白水解酶的性質變化很大，上述條件均視具體對象而變化。 有一些蛋白含疏基

28、， 這些疏基可能是活性所必需。 在提 取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA,后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質帶一些非共價鍵結合的配基。 提取時要注意保護，不 要使酸基丟失。（3）操作步驟 單層細胞的培養，用室溫PBS洗細胞一次，然后甩干；懸浮培養的細胞，400g離心10min , 收集細胞棄上清液。 對于單層細胞培養，將培養瓶置于冰上，每lOOmm培養瓶加入1 mL溶解緩沖液（4 C預冷）；對于懸浮培養，將盛細胞團的試管置于冰上。按107個細胞加入1. 0ml裂解液（4 C預冷）。保存在冰箱的裂解液可隨時使用。 冰上放置3min ,不時敲擊貼壁細胞

29、培養瓶，或輕搖懸浮培養細胞。 對于單層細胞培養，敲擊培養瓶數次，混合均勻，在冰床上傾斜培養瓶使溶液集中于一側，然后將裂解物移置另一支 1.5mL圓錐形試管。有些研究者喜歡從瓶壁刮取細胞，但除特殊要求外此舉并非必須。 單層培養的細胞或懸浮培養的細胞均以10 000g , 413離心10min ,仔細吸取上清液盛于另一試管，不可攪動細胞團。置冰上。此時，上清液可用于下一步的預處理。腦組織RIPA液提腦組織中的胞漿蛋白做western oRIPA母液（20ml配置示例）Tris 0.158g Nacl 0.18g ddH2O 10ml 濃 Hcl 調 PH至 7.4（約加 100ul ）加 40ul

30、 0.5M 高壓過的 EDTA定容至20ml , 4C保存。使用前加 1mg/ml 的 Aprotinin 100ul/100ml（-20 C 保存）；1mg/ml 的 Leupeptin100ul/100ml（-20 C保存）；200mmol/L PMSF 500ul/100ml（4C保存）；200mmol/L 的Na3VO4 500ul/100ml（4C保存），200mmol/L 的 NaF 500ul/100ml（4 C保存）。因加完酶的RIPA液4C只能保存五天，所以母液可以多配置，臨用前再加酶。腦組織蛋白提取步驟：1. 在冰上使玻璃平皿預冷。2. 把腦組織放在預冷的玻璃平皿上，用剪刀

31、將腦組織剪碎。3. 用RIPA液懸浮腦組織。每 250mg腦組織加1ml的RIPA。4. 冰上勻漿腦組織，直至勻漿光滑（大致用30min ,多勻漿幾次，每次勻漿間隔1min以上）。5. 將勻漿轉移到預冷的 Eppendorf管中。6.4 C離心，8,2000 rpm 20min 留上清，棄沉淀。7. 轉移上清至另一離心管中。8.4 C離心，18,000 rpm 45min 。9.保存上清。（含有胞漿蛋白和部分亞細胞結構中的膜蛋白）。脂肪組織蛋白質的提取將脂肪組織樣品置于玻璃勻漿器中，按每毫克樣品2l裂解液的比例分別加入相應體積的裂解液（9 mol/ L 尿素,4 %CHAPS ,65 mmol

32、/ L DTT），冰浴中用玻璃勻漿器上下勻漿共15次。將勻漿液置于 eppendorf管中，4 C、15 000 r/ min 離心1 h后吸取少量上清液，用Bradford法測定總蛋白質濃度，其余上清液于-78 C凍存備用。肝臟組織蛋白的提取1. 斷頭處死大鼠，（盡量讓血液流掉多些），取100-200毫克，冰生理鹽水洗 2次。2. 將肝臟用剪刀煎碎，倒入加入3倍體積的Lysis buffer緩沖液：10 mmol/L Hepes2NaOH （pH7. 8） 。 15mmol/L KCl , 1 mmol/L MgCl2 。 0. 1 mmol/L EDTA ,1 mmol/L DTT ,1 mmol/L PMSF , l g/ml Leupeptin3. 用玻璃勻漿器勻漿（冰上進行）后，充分勻漿。4.12000rpm , 4度，離心 30分鐘取上清。腸黏膜組織蛋白的提取目的：WESTERN BLOT 檢測凋亡相關蛋白的表達應用TRIPURE提取蛋白質步驟：1. 含蛋白質上清液中加入異丙醇：