1、實驗四 人類染色體的識別與核型分析一、實驗目的1. 學習染色體核型的分析方法;2. 了解人類染色體的特征。二、實驗原理1 染色體組型（核型）是指生物體細胞所有可測定的染色體表型特征的總稱。包括：染色 體的總數，染色體組的數目，組內染色體基數，每條染色體的形態、長度、著絲粒的位置， 隨體或次縊痕等。染色體組型是物種特有的染色體信息之一，具有很高的穩定性和再現性。組型分析能進行染色體分組外， 還能對染色體的各種特征做出定量和定性的描述，是研究染色體的基本手段之一。 利用這一方法可以鑒別染色體結構變異、 染色體數目變異，同時也是 研究物種的起源、遺傳與進化，細胞遺傳學，現代分類學的重要手段。2 人類

2、的單倍體染色體組 （n=23）上約有30000-40000個結構基因。平均每條染色體上有 上千個基因。各染色體上的基因都有嚴格的排列順序， 各基因間的毗鄰關系也是較為恒定的。 人類的24種染色體形成了 24個基因連鎖群，所以，染色體上發生任何數目異常、甚至是微小的結構變異，都必將導致許多獲某些基因的增加或減少，從而產生臨床效應。 染色體異常常表現為具有多種畸形的綜合征，稱為染色體綜合征，其癥狀表現為多發畸形、智力低下和生長發育異常，此外還可看到一些特征性皮膚紋理改變。染色體畸變還將導致胎兒死產或流產。染色體病已成為臨床上較常見的危害較為嚴重的病種之一，染色體病的檢查、診斷已經成為臨床實驗室檢查

3、的重要內容。1960年，在美國Denver市召開了第一屆國際遺傳學會議，討論并確定正常人核型 （karyotype）的基本特點即Denver體制，并成為識別人類各種染色體病的基礎。按照Denver體制，將待測細胞的染色體進行分析和確定是否正常，以及異常特點即為核型分析。人類染色體分組及形態特征見表 1。表1人類染色體分組及形態特征（非顯帶標本）組別染色體序號形態大小著絲粒位置次縊痕隨體A1-3最大M(1、3)SM (2)I號染色體常見B4-5次大SMC6-12,X （介于 7-8之間）中等SM9號染色體常見D13-15中等ST有E16-18小M (16)SM16號染色體常見F19-20次小MG

4、21-22,Y最小ST有(22、 21)A組：1-3號，可以區分。1號，最大，M，長臂近側有一次縊痕；2號，較大，SM ; 3號，較大，比1號染色體段1/3-1/4 ）。B組：4-5號，體積較大，SM，短臂相對較短，兩者不容易區分。C組：6-12, X。中等大小，SM，較難區分。6、7、8、11和X染色體的著絲粒略近中 央，短臂相對較長，9、10、12染色體的著絲粒偏離中央。9號染色體長臂有較大次縊痕。X染色體介于7-8之間，但在非顯帶標本中難以區分。D組：13-14號，中等大小，ST,均具有隨體，但不一定顯現或同時顯現，隨體的大小 存在個體的差異。在非顯帶標本中難以區分13-15號染色體。E

5、組：16-18。染色體小。16，M，長臂近著絲粒處有一次縊痕，其存在使16號染色體的大小存在較大差異；17，SM，短臂較長；18，SM，是SM中最短的一對染色體，短臂較 短。在質量較好的標本中，一般可以區分16-18染色體。F組：19-20，次小的M。在非顯帶標本中難以區分。G組：21-22，Y，最小的ST。21、22染色體的長度略有差別，但為適應臨床上已將 Down綜合征沿用為21三體（而顯帶證明與此綜合征相關的是較小的那條染色體）綜合征 的叫法，巴黎會議（1971）建議，把這最小的一對改稱為第21號（而稍大的一對稱為22號），而把這較小的這對第 21號染色體排在稍大的 22號前面。Y染色體

6、的特征，無隨體，染色體一般比21、22長；兩條姊妹染色單體長臂常平行并攏，而21、22則相互叉開；長臂端部常呈現絨毛狀，形態不清晰；與其他染色體相比，著 色往往較深；著絲粒不明顯。根據Denver體制規定，正常核型的描述方式為：46, XX ； 46，XY。3人們用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本后，使每條染色體上出 現明暗相間，或深淺不同帶紋的技術稱為顯帶技術（banding tech nique ）。本世紀70年代以來，顯帶技術得到了很大發展，且在眾多的顯帶技術中（ Q帶、G帶、 C帶、R帶、T帶）。G帶是目前被廣泛應用的一種帶型。染色體標本經胰蛋白酶、NaOH、檸檬酸鹽或尿

7、素等試劑處理后，再用Giemsa染色，可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋，因為它主要是被 Giemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準確的識別每條染色體，并可發現染色體上較細微的結構畸變。三、材料與試劑人類染色體非顯帶、顯帶標本。直尺，剪刀等。四、實驗步驟1 分析的主要依據著絲粒指數（）短臂占整條染色體的百分比：100%p +q臂比一一長臂與短臂的比值（q/p）。反映著絲粒位置的指標。SAT（隨體）1.0-1.7（M）;1.7-3.0（SM）;3.0-7.0（St）;7.0-（Ot）;相對長度

8、（%）某條染色體的相對長度為該染色體長度占染色體總長度的百分比。人類某條染色體的相對長度 （）=該條染色體長度/刀22條染色體長度+X染色體長2 分析的主要步驟 測量、計算，。 配對 剪貼 排列一一原則：從大到小；短臂向上；著絲粒在一條線上；性染色體單排 畫出模式圖（相對比例）原則同上。3. 圖像分析方法20世紀60年代起，人們開始將圖像處理技術應用于核型分析中來。目前已實現計算機自動檢測染色體分散良好的中期細胞，并自動完成核型分析。但這樣的軟件往往價格高昂， 一般的單位是不具有的。 Abode Photoshop 是一款流行的功能強大的圖像處理軟件 ，它比 專門的核型分析軟件容易獲得。 用這

9、款軟件， 可以很容易的完成染色體的排列、 測量等工作。 程序遠較傳統方法簡單。 同時， 他還具備傳統方法所不具備的諸多功能， 諸如去除原照片中 的斑點、 劃痕，調整亮度、 對比， 對交叉重疊的染色體臂進行修整等， 使分析結果比較完美。 基本方法如下：（ 1） 圖片獲得將圖片輸入電腦中。 有兩種獲得圖片的方法： 一是選擇染色體分散良好的有絲分裂中期 的細胞，用數碼相機進行拍攝（ 100 萬像素即可） ，然后輸入電腦；一是按傳統方法拍攝， 再用 300dpi 或更高的分辨率將照片掃描進計算機。（ 2） 圖片處理用剪裁工具（ Crop tool ）將不需要的部分裁去，調整圖像的位置，視情況調整亮度、

10、對 比度；去除斑點、劃痕等，然后儲存圖像，名之為“原始圖” 。在進一步分析前，用橡皮工 具（ Eraser tool ）等將照片中除染色體以外的其他區域擦除干凈。然后將圖像另存為“核型 圖”，利用這張背景干凈的“核型圖”進行核型分析。（ 3） 圖片分析 根據目測，對染色體進行大致歸攏。首先將一組染色體中非常明顯（如最長、最短，具 有隨體等）、較易分辨的同源染色體進行配對，歸類。其余的染色體可以根據自己的判斷， 暫且將它們配對。按從長到短的順序或其他規則， 將這些配對的染色體排列起來。 然后，測 量各條染色體的總長及各臂長度。 根據測量結果， 再對第一步中 “誤配” 的染色體進行調整。將染色體大

11、致歸類的過程僅需要反復使用套索（Lasso）與自由變形（Free transform ）兩個工具即可。用套索工具從圖中圈選同源染色體，從Edit菜單中選擇Free transform，此時被圈選的染色體外出現一個矩形的框， 用鼠標按住矩形框的一個角可自由地旋轉被圈選中 的染色體， 使短臂朝上， 長臂朝下。 而將鼠標伸入矩形框中并按住，則可將選中的染色體拖 向任何位置。移動到目的地后，按回車鍵又可回到套索工具中來。自由變形的快捷鍵是 Ctrl+T,使用此快捷鍵可省力不少。重復上述過程，將所有同源染色體配成對。在配對過程 中，可借助放大工具（ zoom tool ），看清染色體的細節。染色體間如存

12、在交叉重疊, 我們可以同時處理幾個染色體重疊較少的細胞, 先用套索工 具小心地將疊在上面的染色體圈選、 移走, 再從另一張照片找到相應的細節,用橡皮圖章工具（ clone stamp tool ）仔細地“克隆”到因“分離”而造成的“斷臂”處。注意,克隆前要 將兩個染色體的尺寸調整成一樣大。這樣“修補”后的染色體比“嵌合體”式的染色體特征 更典型。視需要在畫布中拉一條或幾條參考線, 選用套索與自由變形兩種工具, 按核型分析中染 色體排列的規則,圈選并拖動配好對的染色體排列,將著絲點排在參考線上。測量每條染色體的總長與臂長，調整"誤配”的染色體。在菜單中選Editf preference

13、tGuide、Grid&Slice，將其中的 Grid line every 設為 1cm, Subdivision 則可視精度需要設為 10或其他值，在菜單中選 View tRuler、View tShowGrid顯示標尺與網格， 將圖像放大到 300%左右,根據網格線標示準確測量每條染色體的長度及相應的臂長,并做記錄。由此讀 出的尺寸即是被掃描的原始照片中的染色體的尺寸, 雖然顯示在屏幕上的染色體要比原始照 片中的大。 如果一條染色體臂是彎曲的, 可按前文敘述的方法圈選并旋轉染色體, 分段測量。 這種測量方法既簡便又準確。算出每條染色體的總長、 臂長、 臂比等參數。 這些參數最為接近的兩條染色體為同源染 色體。根據這些結果,對目測有誤的配對結果進行調整。調整“核型圖”畫布的大小，將“原始圖”移進“核型圖”中來，按需要調整大小和位 置。用文字工具（type tool ）在圖的下方對核型圖做些說明。合并所有的圖層。另存成“核 型分析”。最后，用光澤照片紙或高分辨率紙將結果打印出來或插入到其他文檔中即可。五、結果分析1根據所給定的染色體圖片（非顯帶和顯帶標本）進行測量，結果填寫表2表2 人類染色體分析數據編號絕對長度相對 長度短臂長臂臂比著