1、膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)擊次數(shù)：13發(fā)表于：2008-08-19 14:02轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園來(lái)源：丁香園1、蛋白質(zhì)的處理：膠體金標(biāo)記蛋白的制備膠體金對(duì)蛋口的吸附主要取決丁- ph值，在接近蛋口質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢i古i的結(jié) 合物。如果膠體金的ph值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大 小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。（1）待標(biāo)記蛋白溶液的制備將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005mol/l ph7.0 nad溶液中4°c透析過(guò)夜，以除 去多余的鹽離子，然后100 000g4°c離心1h,去除聚合物。（2）待

2、標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備以0.1mol/l k2co3或0.1mol/l hci調(diào)膠體金液的ph值。標(biāo)記igg時(shí)， 調(diào)至9.0；標(biāo)記mcab時(shí)，調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記spa時(shí)，調(diào)至5.96.2； 標(biāo)記cona時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和索時(shí)，調(diào)至910.由于膠體金溶液可能損壞ph計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)ph時(shí)，采用精密ph試紙測(cè)定為宜。由丁鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必 須注意，蛋口質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄清無(wú)細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離了和硼酸根離了的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表ifli而

3、減翦膠體金對(duì)蛋h質(zhì) 的吸附。2. 蛋白質(zhì)最適用量的選擇：膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求,將膠體金調(diào)好ph之后,分裝10管,每管1ml.（2）將標(biāo)記蛋白（以igg為例）以0.005mol/lph9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5pg/ml-50pg/mi,分別取1ml,加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1 ml稀釋液。（3 ） 5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%naci溶液，混勻后靜置2h,觀察結(jié)果。（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的 聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白雖達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定雖的各管仍保持紅色不變。

4、以穩(wěn)定1 ml膠體金溶液紅色不變 的最低蛋口質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋h質(zhì)的最低用量，在實(shí)際丁作小，可適當(dāng)增加1 0%20%。將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml（禽蛋白質(zhì)540ug）加到1 ml膠體金溶液屮，另 設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，5分鐘后加入0,1ml 10%naci溶液，混勻厲靜置2小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠 將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋口量再加10%即為最佳標(biāo)記蛋白量。3、標(biāo)記：膠體金與蛋白質(zhì)（igg）的結(jié)合將膠體金和igg溶液分別以0.1mol/l k2co3調(diào)ph至9.0,電磁攪樣igg溶液，加入膠體金溶液，繼 續(xù)攪樣10min,加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋h與膠

5、體金聚介發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5%胎牛血淸（bsa）和1%聚乙二醇（分子量20kd）。加入的量：5%bsa使溶液終濃度為1 %； 1%聚乙二醉加至 總?cè)芤旱? /10.在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附 量蟻大。下述標(biāo)記步驟最為常見(jiàn)： 用0、1mol/l k2co3或0.1mol/l hci調(diào)節(jié)金溶膠至所需ph（標(biāo)記s p a時(shí)調(diào)到ph6.0）。 于100ml金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋h質(zhì)溶液（休積為23ml）,攪拌23分鐘。 加入5m i 1 %peg20000溶液。 于10000100000g離心3060分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離

6、心條件），小心吸去上清液（切忌 傾倒）。 將沉淀懸浮于一定體積含0.20.5mg/ml peg20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù), 濃度以a1cm/540nm=1.5左右為宜，以0.5mg/mi疊氮鈉防腐，置4°c保存。 包被后的金溶膠也可濃縮后于sephadex g-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含0.1 % b s a的緩沖 溶液洗脫。通常用igg包被的金溶膠洗脫液ph為8.2,以a蛋白包被的金溶膠洗脫液為ph7.0.以上操作中應(yīng)注意，一切溶液屮不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。4、膠體金標(biāo)記蛋白的純化（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋

7、h的利啖及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí) 間。用bsa做穩(wěn)定劑的膠體金一羊抗兔igg結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min, 5nm金膠 粒丿u 1 800r/min） 20min,棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物）|j 6 000g, 4°c離心1h； 20 nm40nm膠體金結(jié)合物，14 000g, 4°c離心1h.仔細(xì)吸出上淸，沉淀物用含1 %bsa的pb液（含0. 02%nan3）,將沉淀重懸為原體積的1 /10, 4°c保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50%甘油可貯存于-18°c保存 一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑

8、，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用1 0%30%蔗糖或什油進(jìn)行密 度梯度離心，分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。（2）凝膠過(guò)濾法：此法只適用于以bsa作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化°將膠體金蛋白結(jié)合物裝入 透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1 /51 /10.再經(jīng)1 500r/min離心20min.取上消加至sepha cryl s-400 （丙烯葡聚糖凝膠s-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm x 20cm,加樣量為床體枳的1 / 10,以 0.02mol/l pbs 液洗脫（內(nèi)含 0.1 %bsa, 0.05%nan3, ph&2 者用 igg 標(biāo)記物

9、），流速為8ml/h.按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，仃時(shí)略混濁，內(nèi)含人顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼z為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的増加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo) 記的蛋口組分。將純化的膠體金蛋口結(jié)合物過(guò)濾除菌、分裝，4°c保存。最終可得到70%80%的產(chǎn)量。5、膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定（1 ）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)晝用支持膜的繚網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）離取金標(biāo)蛋白試劑，自然于燥后直接在透 射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。（2）膠體金溶液的od520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)51 onm550nm z間出現(xiàn)故大吸收值峰。 ffl0.02mol/lph8.2 pbs 液（含 1%bsa, 0.02%nan3）將膠體金蛋白試劑作 1 ： 20 稀禪，od520 =0.25左右。一般應(yīng)用液的od520應(yīng)為0.20.4。（3）金標(biāo)記