1、第一章緒論分子生物學 :從分子水平研究生物大分子的結構與功能從而闡明生命現象本質的科學，主要指遺傳信息的傳遞（復制）、保持（損傷和修復） 、基因的表達（轉錄和翻譯）與調控。分子生物學研究內容 DNA重組技術（基因工程）1、可被用于大量生產某些在正常細胞代謝中產量很低的多肽;2、可用于定向改造某些生物的基因組結構;3、可被用來進行基礎研究 基因的表達調控1 信號轉導研究;2 轉錄因子 ;3 研究 RAN 剪接 生物大分子的結構和功能研究(結構分子生物學） 基因組、功能基因組與生物信息學研究第二章染色體和DNA 復制時其中一條子鏈的合成是連續的，而另一條子鏈的合成是不連續的，故稱半不連續復制在 D

2、NA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續合成的鏈為前導鏈；合成方向與復制叉移動的方向從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子相反，形成許多不連續的片段，最后再連成一條完整的DNA 鏈為滯后鏈。DNA 的復制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開 ;DNA 的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。RNA 引物的合成 :DnaB 蛋白活化引物合成酶，引發RNAori(或引物的合成。o）、富含A、 T的區段引物長度約為幾個至10 個核苷酸，DNA 鏈的延伸切除 RNA 引物，填補缺口，連接相鄰的DNA 片段復制時，解鏈酶等先將DNA 的一段雙鏈解開，形成復制點，這個復制點的形狀象一個叉子，故稱為復

3、制叉在 DNA 復制過程中，前導鏈能連續合成，而滯后鏈只能是斷續的合成53的多個短片段，這些不連續的小片段稱為岡崎片段。復制的幾種主要方式P421、雙鏈環狀、型復制、雙向等速2、滾環型：單向復制的特殊方式如： 174的雙鏈環狀DNA 復制型（ RF)（ 1）模板鏈和新合成的鏈分開;（ 2）不需 RNA 引物，在正鏈 3 OH 上延伸（ 3）只有一個復制叉 ;3、 D 環復制真核生物中單向復制的特殊方式如：動物線粒體DNA 的復制特點DNA1、真核生物每條染色體上有多個復制起點，多復制子（約2、復制叉移動的速度較慢（約50bp 秒），僅為原核生物的150bp 左右）；1 10。3、真核生物染色體

4、在全部復制完之前 ,各個起始點不再重新開始 DNA 復制；真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點4。、真核生物有多種DNA聚合酶。5、真核生物DNA 復制過程中的引物及岡崎片段的長度均小于原核生物。（真核岡崎片段長約100-200bp ，原核岡崎片段長約 1000-2000bp 。原核和真核生物DNA 的復制特點比較復制起點（ ori ）：原核一個，真核多個；復制子：原核一個，真核多個；復制子長度：原核長；真核短；復制叉：原核多個；真核多個；復制移動速度：原核較快；真核較慢；真核生物染色體在全部完成復制前，各起始點的DNA 復制不能再開始。而在快速生長的原核生物中，復制起點上可以連續開始新

5、的DNA 復制。原核生物染色體的復制與細胞分裂同步，可以多次復制；真核生物染色體的復制發生在S 期，是細胞分類的特定時期，而且僅此一次。DNA 修復系統錯配修復堿基切除修復核甘酸切除修復功能恢復錯配切除突變的堿基修復被破壞的DNADNA 直接修復SOS 系統修復嘧啶二體或甲基化DNA ， DNA的修復，導致變異第三章生物信息的傳遞（上）轉錄錄 :生物體以 DNA 為模板合成 RNA 的過程參與轉錄的物質原料 : NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)模板 :DNA; 酶 : RNA 聚合酶 ;其他蛋白質因子RNA 合成方向： 5'3'與 mRNA 序列相同的那條 DN

6、A 鏈稱為編碼鏈；將另一條根據堿基互補原則指導mRNA 合成的 DNA 鏈稱為模板鏈。結構基因： DNA 分子上轉錄出 RNA 的區段，稱為結構基因。轉錄單元（ transcription unit ）一段從啟動子開始至終止子結束DNA 序列。RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶（大腸桿菌為例）全酶=核心酶 + 因子大腸桿菌 RNA 聚合酶的組成分析（看書）真核細胞的三種RNA 聚合酶特征比較（看書）RNA 聚合酶與 DNA 聚合酶的區別RNA 聚合酶DNA 聚合酶大小 (M)大， 4.8× 105dol小， 1.09× 105dol引物無有產物較短，游離較長，與模板以氫

7、鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無53， 35校對合成能力無有修復能力無有啟動子定義：指能被RNA 聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA 序列。TATA 區：酶的緊密結合位點（富含AT 堿基，利于雙鏈打開）TTGACA 區：提供了 RNA 聚合酶全酶識別的信號轉錄起點：與新生RNA 鏈第一個核甘酸相對應DNA 鏈上的堿基真核有三種不同的啟動子和有關的元件啟動子最為復雜，它和原核的啟動子有很多不同真核生物啟動子的結構：核心啟動子（core promoter）和上游啟動子元件（upstream promoter element ， UPE ）核心啟動子：指保證RNA 聚合

8、酶轉錄正常起始所必需的、最少的DNA 序列，包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上游 TATA 區作用：選擇正確的轉錄起始位點，保證精確起始上游啟動子元件包括 CAAT 盒（ CCAAT ）和 GC 盒（ GGGCGG ）等（ CAAT ： -70 - -80bpGGGCGG ： -80 - -110bp)作用：控制轉錄起始頻率。轉錄的基本過程： 1、起始位點的識別： RNA 聚合酶與啟動子 DNA 雙鏈相互作用并與之相結合的過程。 RNA 聚合酶全酶（ 2 )與模板結合2、轉錄起始RNA RNA 聚合酶全酶 (鏈上第一個核甘酸鍵的產生2)與模板結合DNA 雙鏈解開在 RNA 聚合酶作用下發生第一次

9、聚合反應，形成轉錄起始復合物3、 RNA 鏈的延伸亞基脫落， RNA pol 聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA 模板前移；在核心酶作用下，NTP 不斷聚合， RNA 鏈不斷延長。注意： 9 個核苷酸以前還在啟動子區，容易脫落，一旦形成9 個以上的核苷酸并離開啟動子區，轉錄正式進入眼神階段。4、轉錄終止終止子（ terminator ）：位于基因的末端，在轉錄終止點之前有一段回文序列（反向重復序列）約真核生物終止 : 由一段特定序列5 AATAAA 3和回文序列（反向重復序列）組成。分為兩類：6-20bp 。強終止子內部終止子：不依賴Rho ( )因子的終止。弱終止子需要 因子（ r

10、ho factor ），又稱為 依賴性終止子（Rho-dependent terminator）1)當 RNA 鏈延伸到轉錄終止位點時，RNA 聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離， 轉錄泡瓦解， DNA恢復成雙鏈狀態，而RNA 聚合酶和RNA 鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉錄的終止。終止位點上游一般存在一個富含GC 堿基的二重對稱區，RNA 形成發夾結構； 在終止位點前面有一段由4-8 個 A 組成的序列， RNA 的 3端為寡聚U 終止效率與二重對稱序列和寡聚U 的長短有關，長度越長效率越高2)依賴 因子： 六聚體蛋白、 水解各種核甘三磷酸促使新生RNA 鏈從三元轉錄復

11、合物中解離出來，從而終止轉錄增強子（ P78） :概念：在啟動區存在的能增強或促進轉錄的起始的特點： 1.遠距離效應；2.無方向性； 3.順式調節；強子可以對外部信號產生反應。真核生物的轉錄過程(看書）DNA 序列。但不是啟動子的一部分。4.無物種和基因的特異性；5.具有組織特異性；6.有相位性；7.有的增1. 轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區段比原核生物多樣化，轉錄起始時，RNA-pol不直接結合模板，其起始過程比原核生物復雜。2.轉錄延伸3. 轉錄后加工真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉錄與翻譯同步的現象。5端加帽 ;3端加尾； RNA 的剪接 ;RNA 的編輯

12、帽子結構功能：能被核糖體小亞基識別，促使mRNA 和核糖體的結合；m7Gppp 結構能有效地封閉mRNA 5末端，以保護 mRNA 免受 5核酸外切酶的降解，增強 mRNA 的穩定。多聚腺苷酸尾巴功能：提高了 mRNA 在細胞質中的穩定性。2. 試比較原核和真核細胞的 mRNA的異同 . 原核生物原核生物 mRNA的半衰期短。許多原核生物mRNA以多順反子形式存在。 （單順反子mRNA：只編碼一個蛋白質的mRNA。多順反子mRNA：編碼多個蛋白質的mRNA）其 5端無帽子結構，3端沒有或只有較短的poly(A)。 SD序列： 原核生物起始密碼子AUG上游 7-12 個核苷酸處有一被稱為SD序列

13、的保守區。 mRNA中用于結合原核生物核糖體的序列P85原核細胞mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽。（本條供參考）原核生物常以AUG（有時 GUG，甚至 UUG）作為起始密碼子（本條供參考）真核生物：其 5端存在帽子結構。絕大多數真核生物mRNA具有 poly(A)尾巴。（組蛋白除外） 以單順反子的形式存在其 RNA最多只能編碼一個多肽。（本條供參考）真核生物幾乎永遠以AUG為起始密碼子。 （本條供參考）RNA合成與 DNA合成異同點相同點：1、都以 DNA 鏈作為模板2、合成的方向均為5 33、聚合反應均是通過核苷酸之間形成的3 ,5 -磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈延長。不同點：模板復制兩條

14、鏈均復制轉錄模板鏈轉錄（不對稱轉錄）原料dNTPNTP酶DNA 聚合酶RNA 聚合酶產物子代雙鏈 DNA （半保留復制）mRNA ， tRNA ， rRNA配對A-T ； G-CA-U ； T-A ； G-C引物RNA 引物無mRNA3 類內含子剪接核酶的定義及發現第四章翻譯： 指將 mRNA 鏈上的核甘酸從一個特定的起始位點開始，按每三個核甘酸代表一個氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。蛋白質合成的場所是核糖體蛋白質合成的模板是mRNA模板與氨基酸之間的接合體是tRNA蛋白質合成的原料是20 種氨基酸三聯子密碼定義： mRNA 鏈上每三個核甘酸翻譯成蛋白質多肽鏈上的一個氨基酸，這三個核甘

15、酸就稱為密碼子或三聯子密碼 (triplet coden)遺傳密碼的性質：1、 連續性：編碼蛋白質氨基酸序列的各個三聯體密碼連續閱讀，密碼間既無間斷也無交叉。基因損傷引起 mRNA 閱讀框架內的堿基發生插入或缺失，可能導致框移突變(frameshift mutation) 。從 mRNA 5AUG 到3多肽鏈，稱為開放閱讀框架(open reading frame, ORF) 。2、簡并性：由一種以上密碼子編碼同一個氨基酸的現象稱為簡并（degeneracy），對應于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子（ synonymous codon）。編碼某一氨基酸的密碼子越多，該氨基酸在蛋白質中出現的頻率

16、就越高。Arg 例外3、通用性與特殊性蛋白質生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。已發現少數例外，如動物細胞的線粒體、植物細胞的葉綠體。4、擺動性：轉運氨基酸的tRNA 上的反密碼子需要通過堿基互補與mRNA 上的遺傳密碼子反向配對結合，在密碼子與反密碼子的配對中，前兩對嚴格遵守堿基配對原則，第三對堿基有一定的自由度，可以“擺動” ，這種現象稱為密碼子的擺動性tRNA tRNA的結構的功能1、二級結構：三葉草形2、三級結構：“ L”形氫鍵1、解讀mRNA的遺傳信息2、運輸的工具，運載氨基酸tRNA 有兩個關鍵部位：3端 CCA ：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。與mRNA結合部位反密碼子

17、部位tRNA tRNA憑借自身的反密碼子與的種類mRNA鏈上的密碼子相識別，把所帶氨基酸放到肽鏈的一定位置。1、起始tRNA和延伸tRNA：能特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA稱起始tRNA ，其他tRNA統稱為延伸tRNA 。真核生物：起始密碼子原核生物：起始密碼子AUG 所編碼的氨基酸是Met ，起始AUG所編碼的氨基酸并不是AA-tRNA 為甲硫氨酸本身Met-tRNAMet 。, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA為fMet-tRNAfMet2、同工tRNA代表同一種氨基酸的tRNA 稱為同工tRNA 。同工 tRNA 既要有不同的反密碼子以識別該氨基酸的各種同義密碼，又要

18、有某種結構上的共同性，能被相同的氨基酰-tRNA 合成酶識別（P119）。3、校正tRNA無義突變校正錯義突變校正tRNA ：可以通過改變反密碼子區校正無義突變tRNA ：通過反密碼子區的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正常的蛋白質。無義突變： 在蛋白質的結構基因中，一個核苷酸的改變可能使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子（ UAG 、UGA 、UAA ），使蛋白質合成提前終止，合成無功能的或無意義的多肽，這種突變就稱為無義突變。錯義突變：由于結構基因中某個核甘酸的變化使一種氨基酸的密碼子變為另一種氨基酸的密碼子，這種基因突變叫錯義突變。GGA （甘氨酸）AGA （精氨酸）核糖體的結構與功

19、能1.核糖體是由rRNA（ribosomal ribonucleicacid）和多種蛋白質結合而成的一種大的核糖核蛋白顆粒，蛋白質肽鍵的合成就是在這種核糖體上進行的。2.核糖體的功能：合成蛋白質在單個核糖體上，可化分多個功能活性中心，在蛋白質合成過程中各有專一的識別作用和功能。 mRNA 結合部位小亞基結合或接受AA-tRNA部位（ A 位）大亞基結合或接受肽基tRNA 的部位大亞基肽基轉移部位（P 位）大亞基形成肽鍵的部位（轉肽酶中心）大亞基蛋白質合成的過程(生物學機制）氨基酸的活化翻譯的起始肽鏈的延伸肽鏈的終止蛋白質前體的加工肽鏈怎樣進行進行終止的？終止因子RF1 ：識別終止密碼子UAAR

20、F2 ：識別終止密碼子UAARF3 ：具 GTP 酶活性，刺激和 UAG和 UGARF1 和RF2活性，協助肽鏈的釋放真核生物只有一個終止因子（核糖體循環步驟？eRF）蛋白質的運轉機制1、翻譯-運轉同步機制2、翻譯后運轉機制(1)線粒體蛋白質跨膜運轉(2)葉綠體蛋白質的跨膜運轉3、核定位蛋白的運轉機制4、蛋白質的降解蛋白質運轉的兩種方式（蛋白質運轉模式？怎樣進行？）一 .翻譯 -運轉同步（ co-translational translocation ）：是即將進入內質網的蛋白質的易位方式；蛋白質正合成的時候就可與運轉裝置結合；蛋白質合成時，核糖體定位于內質網表面，稱膜結合核糖體(membra

21、ne-bound ribosome ）。分泌蛋白質大多是以同步機制運輸的二 .翻譯后運轉（ post-translational translocation ）：蛋白質翻譯完成后從核糖體上釋放，然合擴散至合適的靶膜并與運轉裝置結合。蛋白質合成時，其核糖體不與任何細胞器相連，稱游離核糖體(free ribosome)在細胞器發育過程中，由細胞質進入細胞器的蛋白質大多是以翻譯后運轉機制運輸的。參與生物膜形成的蛋白質，依賴于上述兩種不同的運轉機制鑲入膜內。信號肽假說內容：（ 1）蛋白質合成起始首先合成信號肽（ 2） SRP（信號識別蛋白）與信號肽結合，翻譯暫停（ 3） SRP 與 SRP 受體結合，

22、核糖體與膜結合，翻譯重新開始（ 4）信號肽進入膜結構（ 5）蛋白質過膜，信號肽被切除，翻譯繼續進行（ 6）蛋白質完全過膜，核糖體解離第五章分子生物學研究法基因操作：主要包括DNA 分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR 擴增等。基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入新的宿主細胞內并獲得持續穩定增值能力和表達。基因工程所需元件：限制性內切酶 ;連接酶 ;載體 ;受體細胞常用的工具酶限制性核酸內切酶切割 DNADNA 連接酶生成 3 - 5磷酸二酯鍵DNA 聚合酶探針標記、補平 3末端反

23、轉錄酶cDNA 合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性內切核酸酶(restrictive endonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA 鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（ “分子手術刀”）。限制酶的命名命名原則：限制酶由三部分構成，即菌種名、菌系編號、分離順序限制性內切酶的特點：（ 1） . 限制性內切酶一般識別完全的回文結構，它具有兩個基本特點： 能夠在中間劃一個對稱軸，兩側的序列兩兩對稱互補配對； 兩條互補鏈的5 3的序列組成相同，即將一條鏈旋轉180 度，則兩條鏈重疊。（ 2） . 識別 -8 個相連的核苷酸組成的特定核甘酸序列。

24、（ 3） 切割方式有兩種錯位切割，產生互補性的粘性末端。錯位切割所產生的 DNA 末端，兩條鏈不平齊，一條鏈凸出，一條鏈凹進，這種末端稱為黏性末端。帶有相同黏性末端的 DNA 分子很容易在末端互補配對，連接成新的重組分子。沿對稱軸切割，產生平齊末端（ 4 具有同裂酶 :來源不同的限制性內切酶識別同樣的核甘酸靶序列。如： BamH I 和 Bst I 具有相同的識別序列GGATCC 。（ 5） 具有同尾酶 :來源各異，識別的靶序列也不同，但卻產生相同的黏性末端，故同尾酶產生的黏性末端可以連接起來，但一般不能再被原來的任何一種酶所切割。如： Taq I 、 Cla I 和 Acc I 為一組同尾酶

25、，其中任何一種酶切割DNA 分子都產生5端 CG 凸出的粘性末端。目的基因的獲得1）化學合成法：較短的基因（60-80bp ）用途： PCR 引物 ;測序引物 ;定點突變 ;核酸雜交探針重組 DNA 技術（ Recombinant DNA Technique）是人類根據需要選擇目的基因（DNA 片段）在體外與基因運載體重組，轉移至另一細胞或生物體內，以達到改良和創造新的物種和治療人類疾病的目的。基因組文庫和cDNA 文庫基因庫，也叫基因組文庫，DNA 文庫（DNA library)是指用克隆的方法將一種生物的全部基因組長期以重組體方式保持在適當的宿主中。將生物細胞基因組DNA 通過限制性內切酶

26、部分酶解后所產生的基因組DNA 片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。這樣保存的基因組是多拷貝、多片段，當需要某一片段時，可以在這樣的“圖書館”中查找（沒有目錄）。cDNA 文庫 (P175): 首先獲得mRNA ，反轉錄得cDNA ，經克隆后形成文庫。cDAN 文庫和基因組文庫的不同之處在于，cDNA 文庫除卻了mRNA 拼接過程中除去的內含子等成分，便于 DNA重組的使用。其復雜性比基因文庫低得多。主要用于研究蛋白質的氨基酸順序，可根據克隆的組建一個 cDNA 文庫的步驟：1)分離表達目的基因的組織或細胞2)從組織或細胞中制備總體RNA 和 mRN

27、AcDNA分子的核酸序列直接推導出來。3）第一條 cDNA 鏈的合成，需要 RNA 模板，cDNA 合成引物，逆轉錄酶， 4 種脫氧核苷三磷酸以及相應的緩沖液 (Mg2+) 等。4)第二條 cDNA 鏈的合成5) cDNA 的甲基化和接頭的加入6)雙鏈 cDNA 與載體的連接據研究目的，選擇克隆策略=> 控制基因表達的調控序列；中不存在的特定序列cDNAlibrary=> 蛋白質的氨基酸序列載體（ Vector） : 將外源目的DNA 導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。載體的條件分子小（10 Kb ）； 有限制酶酶切位點； 可自主復制；有足夠的copy 數；帶篩選的標志用于原

28、核生物宿主的載體：質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體用于真核生物宿主的載體：細菌人工染色體載體酵母人工染色體載體噬菌體 PI 載體和 PACPlasmid：質粒是細胞染色體或核區DNA 外能夠自主復制的很小的環狀DNA 分子質粒載體特點1、 至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。2、 至少應有一個克隆位點，以供外源DNA 插入。3、 至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA 分子是否進入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數。標記基因的種類 1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子） 2）生化標記基因常用的遺傳標記基因及其作用機制1) 四環素抗性基因（ Tetr ， T

29、cr）Tetracycline 可結合在核糖體 30s 亞基中的一種蛋白質分子上，抑制核糖體的轉位過程。四環素抗性基因編碼一種 399 AAs 蛋白質，與細菌細胞膜結合，阻止四環素分子進入細菌細胞。2) 氨芐青霉素抗性基因（Ampr ， Apr ）Ampicillin 可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。可特異地切割氨芐青霉素的 內酰胺環，使氨芐青霉素失活。氯霉素抗性基因（Cmlr， Cmr ）Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，Chlorophenicol可結合在核糖體50 S亞基上，阻止蛋白質合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，使氯霉素乙酰化，導致乙酰化的氯霉素不能結

30、合在核糖體上。4) 卡那霉素 (Kanr),新霉素 (Neor) 和 G418 抗性 (G418r) 基因Kanamycin ，Neomycin 和 G418 均可結合在核糖體上阻止蛋白質的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內。5） 半乳糖苷酶基因（ 半乳糖苷酶基因有lacZ 和 lacZ ）1021 AAs（ 和 鏈）lacZ（ lacZ ）中含有多克隆位點，當無外源 DNA 片段插入時，質粒表達 半乳糖苷酶的 -肽，產生有活性的 半乳糖苷酶， 在含有指示劑 X-gal 和誘導劑 IPTG 的存在下， 菌落呈現蘭色； 外源基因的插入后， 破壞了 lacZ -肽基

31、因的結構，細菌內不能產生 半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 半乳糖苷酶基因的優點: a. 酶催化 X-Gal 水解為蘭色產物， 檢測直觀；b. lacZ 編碼 5 -端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性；c. lacZ 和 鏈基因的分別表達可使載體小而容量大分子雜交：是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用標記的探針與被固定的分子雜交,經顯影后顯示出目的分子所處的位置的過程.分子雜交包括： DNA-DNA 雜交（原位雜交、點雜交、 Southern 雜交），DNA-RNA 雜交（ Northern 雜交）及蛋白雜交（ Western 雜交）大多數的核酸雜交反應都是在固體支

32、持物（濾膜）上進行的。采用濾膜進行核酸雜交是因為它們易于操作及保藏。常用的濾膜有：醋酸纖維素濾膜、重氮芐氧甲基 (DBM)- 纖維素膜；氨基苯硫醚 (APT)- 纖維素膜，尼龍膜及濾紙等。Probe（雜交探針） ：探針，是由放射性同位素、生物素或熒光染料等進行標記后，能與目的基因片段特異性雜交的已知序列的核酸片段根據探針的來源及核酸性質不同又可分為 DNA 探針， RNA 探針， cDNA 探針，及寡核苷酸探針等幾類缺口平移法（ Nick Translation ）標記探針的原理及過程（看書）DNA 雜交常用的方法（ 1）斑點雜交（ dot and slot hybridization)用途：

33、用于快捷地檢查出菌落中是否有某個基因，但不能檢出基因的大小或重復的程度。原理及步驟：提取 DNA點樣品至膜、干燥、固定探針、 DNA 變性、雜交洗膜、放射自顯影結果分析（二） . Southern DNA 印跡雜交將重組體 DNA 用限制酶切割，分離出目的DNA 后進行電泳分離，再將其原位轉至薄膜上，固定后用探針雜交的方法叫 Southern 雜交。用途：用來檢查DNA 樣品中是否存在有某個特定的基因，而且還可知道其大小及酶切位點的分布。Southern blot 的步驟提取 DNA限制酶消化DNA 片段電泳分離變性轉移至尼龍膜溫育、探針雜交洗膜、放射自顯影、結果分析（三） .菌落印跡原位雜交

34、(in situ hybridization)讓含重組體的菌落或噬菌斑由平板轉移到膜上并釋放出雜交。用途：用于在轉化菌落中篩選帶有目的基因的重組克隆RNA 雜交常用方法Northern RNA印跡雜交DNA ，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法叫原位將 RNA 分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維濾膜或其它化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法，被檢對象為 RNA, 探針為 DNA 或 RNA.用途：用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉錄。原理及步驟：提取總RNA提純分離mRNA瓊脂糖凝膠電泳分離RNA轉移至硝酸纖維素膜雜交檢測蛋白質印跡法（Western bloting)Wes

35、tern blotting 分析(p189)是蛋白質分析的技術在基因表達研究中，應用非常廣泛，因為蛋白質是基因的產物，研究蛋白質的變化來分析判斷基因轉錄的高與低。步驟：細胞提取總蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳轉膜（Western blotting ，常用醋酸纖維膜）固定用化學發光試劑標記（抗體抗原反應）分析相對量以判斷表達量的多少。PCR(polymerase chain reaction) 是模擬體內DNA復制條件，應用DNA聚合酶反應，特異性擴增某一DNA片段的技術。體外程序化的DNA 合成技術。PCR 相關技術 (看書）群體中每個個體（體細胞）的兩套單倍體 DNA 于內含子序列中，表型并沒有改

36、變，這種表現稱為是不完全相同的，一般每DNA 多態100 500bp 就有一個是不相同的，它們多位基因多態性的檢測方法1. PCR-RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)2. PCR-RFLP(Restrict Fragment Length Polymorphroism)3. PCR-SSCP(Single-Stranded Conformation Polymorphroism) RNA 的轉錄后加工；4. 小衛星標記（ minisatellite DNA ）5. 微衛星標記（ microsatellite DNA ）6.單核苷酸多態性（sing

37、le nucleotide polymorphism ,SNP）4. 基因芯片（Gene chip ）分子遺傳標記的應用種質資源的遺傳評估、監測、保護和利用;遺傳圖譜的構建與基因定位第六章原核生物基因表達調控（定）圍繞基因表達過程中發生的各種各樣的調節方式都通稱為基因表達調控轉錄水平的調控；轉錄后的調控；翻譯水平的調控基因表達的方式1、組成性基因表達; 標記輔助選擇.指不大受環境變動而變化的一類基因的表達。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶等代謝過程中十分必須的蛋白質或酶的表達。某些基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續表達，通常被稱為管家基因(house-keeping gene)。如：微管蛋白

38、基因、糖酵解酶系基因、核糖體蛋白基因等。2、適應性表達（誘導和阻遏表達）指環境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。誘導表達（ induction）指在特定環境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產物增加。這類基因稱為可誘導基因。、阻遏表達（ repression）指在特定環境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產物減少。這類基因稱為可阻遏基因。協調表達在一定機制控制下，功能上相關的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協調一致、共同表達，即為協調表達(coordinate expression)，這種調節稱為協調調節(coordinate regulation) 。DNA RNA水

39、平：基因丟失；基因擴增；基因重排；甲基化修飾；染色體的機構狀態水平：轉錄水平調控；RNA 的轉錄后加工；mRNA 從核內向胞漿轉運；mRNA穩定性蛋白質水平：翻譯過程；翻譯后加工；蛋白質穩定性原核基因調控機制的類型1、負調控negative regulation樣的控制系統就叫做負控系統其調節蛋白質叫做阻遏蛋白兩種類型：負控誘導和負控阻遏在沒有調節蛋白質存在時基因是表達的，加入某種調節蛋白質后基因活性就被關閉，這。2、正調控positive regulation在沒有調節蛋白質存在時基因是關閉的，加入某種調節蛋白質后基因活性就被開啟，這樣的控制系統就叫做正控系統。其調節蛋白質叫做無輔基誘導蛋白

40、（激活蛋白)兩種類型 :正控誘導和正控阻遏系統原核生物基因表達調控的特點：調節的主要環節在轉錄水平上進行；因子決定RNA 聚合酶識別特異性；主要通過操縱子模式進行調節；阻遏蛋白對轉錄的抑制作用（阻遏機制）是普遍存在的負調控作用乳糖操縱子與負控誘導系統以及色氨酸與負控誘導系統（重點看）舉例說明原核生物基因表達調控的機理。（參考）在 E.coli 乳糖操縱子中，其結構基因為lacZ,lacy,lacA,這三個基因別離編碼-D 半乳糖苷酶， -D 半乳糖苷透性酶， -D 半乳糖苷轉乙酰酶。其調節基因為lacI, 編碼阻遏蛋白。啟動子為lacP, 操縱基因為 lacO 。負調控：當細胞內無引誘物時，阻

41、遏蛋白能夠與操縱基因聯合。因為操縱基因與啟動子有一定程度的重疊，是以妨礙了RNA聚合酶在-10 序列上形成開放性的啟動子復合物。當細胞內有引誘物存在時，引誘物以極高的濃度與阻遏蛋白快速聯合，從而改變了阻遏蛋白的構象，使之快速地從操縱基因上解離下來。這樣，RNA 聚合酶就能與啟動子牢固聯合并形成開放性啟動子復合物，從而開始轉錄lacZYA 結構基因。正調控：cAMP-CAP復合物是乳糖操縱子的正調控因子。乳糖啟動子有兩個 CAP聯合位點， 一個是在 -70 到 -50（位點 I ）, 另一個是在 -50-D-40（位點 II ）。位點 I 包含一個逆向反復序列，這彷佛是大多數強聯合位點的特征。位

42、點II是一個很弱的聯合位點，但是當cAMP-CAP復合物聯合于位點I 時，位點II 聯合 cAMP-CAP復合物的能力顯著提高。 一旦位點 II 被占領， RNA聚合酶就很快與 -35 序列聯合， 然后在于 -10 序列聯合。轉錄水平上其他的調控方式，以及轉錄后調控(看書 )第八章真核基因表達與調控真核生物基因表達的調控的水平DNA 水平的調控轉錄水平的調控;轉錄后水平的調控;翻譯水平的調控 ;翻譯后水平的調控 ;真核基因組的結構特點1、在真核細胞中，一條成熟的mRNA 鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見的多基因操縱子形式。2、真核細胞 DNA 都與組蛋白和大量非組蛋白相結合，只有一

43、小部分DNA 是裸露的。3、高等真核細胞DNA 中很大部分是不轉錄的，大部分真核細胞的基因中間還存在不被翻譯的內含子。4、真核生物能有序地根據生長發育階段的需要進行DNA 片段重排，還能在需要時增加細胞內某些基因的拷貝數。5、在真核生物中，基因轉錄的調節區相對較大，一般通過改變整個所控制基因5上游區 DNA 構型來影響它與 RNA聚合酶的結合能力。在原核生物中，轉錄的調節區都很小，大都位于啟動子上游不遠處，調控蛋白結合到調節位點上可直接促進或抑RNA 聚合酶與它的結合。6、真核生物的RNA 在細胞核中合成，只有經轉運穿過核膜，到達細胞質后，才能被翻譯成蛋白質，原核生物中不存在這樣嚴格的空間間隔

44、。7、許多真核生物的基因只有經過復雜的成熟和剪接過程才能順利地翻譯成蛋白質。基因家族定義：真核基因組中來源相同,結構相似 ,功能相關的一組基因.可能由某一共同祖先基因經重復和突變產生。外顯子與內含子的可變調控組成型剪接：切除內含子后，將外顯子規范地拼接成成熟的mRNA ，稱為組成型拼接。這樣一個基因只產生一種成熟的 mRNA ，也只產生一種蛋白質產物。選擇性剪接：可調控的選擇性拼接，因而產生不同的成熟mRNA ，翻擇產生不同的蛋白質。真核生物 DNA 水平上的基因表達調控“開放”型活性染色質結構對轉錄的影響；基因擴增；基因重排與轉換；基因丟失；基因擴增是指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現象，

45、它使得細胞在短期內產生大量的基因產物以滿足生長發育的需要，是基因活性調節的一種方式.一個基因可以從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉錄，即在DNA水平上由無功能的基因片斷組合重排成為有功能的基因單位的過程，叫做基因重排基因丟失 :有的生物個體發育早期在體細胞中要丟失部分染色體，而在生殖細胞中保持全部的基因組DNA 甲基化與基因活性的調控DNA 的甲基化： DNA 甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化與表達；DNA 的甲基化能提高該位點的突變頻率，因而可作為誘變劑或致癌因子調節基因表達。甲基化的類型：5甲基胞嘧啶；N6 甲基腺嘌呤；7甲基鳥嘌呤DNA的甲基化機制

46、基因轉錄的機理甲基化達到一定程度時會發生從常規的B-DNA 向 Z-DNA白質因子賴以結合的元件縮入大溝而不利于基因轉錄的起始。的過渡。又由于Z-DNA結構收縮，螺旋加深，使許多蛋DNA甲基化導致某些區域DNA構象變化， 影響蛋白質與DNA的相互作用； 抑制轉錄因子與啟動區DNA的結合效率。真核生物轉錄水平的調控RNA聚合酶；順式作用元件；反式作用因子；轉錄起始的調控真核基因啟動子由核心啟動子和上游啟動子元件（UPE ）兩個部分組成.在基因轉錄起始位點(+1) 及其 5上游大約100200bp 以內的一組具有獨立功能的DNA 序列 .決定 RNA 聚合酶轉錄起始點和轉錄頻率的關鍵元件.核心啟動子 (core promoter) 保證 RNA 聚合酶轉錄正常起始所必需的、最少的DNA 序列。包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上游-25 -30bp 處的 TATA 盒。