1、 本科畢業設計 （論文）題目 SPR 在細胞檢測中的應用 學 院 物理與電子工程學院 年 級 10 級 專 業 電子科學與技術 班 級 Y051101 學 號 Y05110108 學生姓名 顧悅 指導教師 李方強 職 稱 論文提交日期 常熟理工學院畢業設計（論文）2摘要細胞生物學的眾多研究項目一直被認為是生命科學研究領域的重要組成部分。雖然目前有大量的儀器應用于細胞檢測，但其各自因具有需要熒光標記、靈敏度低、對細胞具有破環性、無法實時檢測等一個或多個缺點而限制了細胞檢測技術的發展。而基于表面等離子體共振（SPR）的傳感方法是一種具有無需標記、高通量、高靈敏、可實時檢測等特性的新穎光學檢測方法。

2、因此，將SPR 技術應用于細胞檢測的應用中具有十分重要的意義。 本文主要研究，表面等離子體共振（SPR）傳感技術在細胞檢測中的應用。利用 MATLAB R2012b 軟件對基于角度調制的克萊舒曼型棱鏡耦合傳感模型的各參數進行數值仿真，得出各參數之間的相互關系。通過改變模型各參數，使其在中紅外波段形成最強共振吸收峰（SPW），以增加激發波長的方式來增加檢測深度，從而更準確可靠地完成一些與 SPW 相匹配的生物細胞的測量。關鍵字：SPR；細胞檢測；中紅外；仿真常熟理工學院畢業設計（論文）3AbstractCell Biology has been seen as a very important

3、part of life science research, and cell biology is one of the four basic life science disciplines in our country. There are a large number of instruments used in cell detection, but these instruments have one or more weak points, needing fluorescently labeled, low sensitivity, damaging cells, not re

4、al-time monitoring and etc, limiting the development of Cell Detection Technology. However, SPR sensor is a novel detection method, sensitive, high-throughput, without fluorescently labeled, capable of real-time monitoring and etc. Therefore, the SPR technology for cell detection application has ver

5、y important significance.This paper mainly studies SPR sensing technology in cell detection. To numerical simulation for each parameter of Kretschmann-Raether prism sensor model based on the parameters of angle modulation with MATLAB software. By changing the parameters of the model to be formed in

6、the maximum resonance infrared absorption peak (SPW), to increase the wavelength of the incident wave to increase the detection depth, thus completing the measurement more accurate and reliable SPW several matching the measurements of biological cells.Keywords: SPR; cell detection; infrared band; si

7、mulation常熟理工學院畢業設計（論文）4目錄第一章 緒論 .61.1 概述.61.1.1 細胞檢測的意義 .61.1.2 細胞檢測技術的研究現狀 .71.1.3 細胞檢測技術存在的問題 .121.2 基于 SPR 傳感的細胞檢測.131.2.1 SPR 現象與傳感原理.131.2.2 基于 SPR 傳感的細胞檢測技術概述.151.2.3 SPR 傳感用于細胞檢測的優勢及瓶頸問題.171.3 課題內容和意義.18第二章 SPR 傳感用于細胞檢測的理論分析 .192.1 棱鏡耦合式 SPR 傳感模型.192.2 SPW 的特性.212.2.1 SPW 的傳播特性.212.2.2 SPW 穿透

8、深度與激發波長的關系 .232.3 SPR 細胞檢測模型的建立及分析 .242.3.1 細胞的等效折射率 .242.3.2 SPR 細胞檢測的物理模型 .242.3.3 SPR 傳感的靈敏度分析 .25第三章 SPR 細胞檢測模型的設計 .263.1 Kreschmann SPR 傳感模型的數值模擬.263.2 金屬膜材料與厚度的選擇 .283.2.1 金屬膜材料的選擇 .283.2.2 Ag 膜厚度的選擇 .293.3 Ag 膜的制備工藝 .313.4 Ag 膜 SPR 細胞檢測模型的可行性分析.31常熟理工學院畢業設計（論文）5第四章 總結與展望 .32參考文獻 .33常熟理工學院畢業設計

9、（論文）6第一章 緒論1.1 概述概述1.1.1 細胞檢測的意義細胞組學作為細胞生物學研究的一個前沿分支，它結合了基因組學、蛋白質組學與轉錄組學的技術等，主要對細胞結構以及內部 DNA 或蛋白質的功能進行研究。由此，細胞組學不僅能夠使人類進一步認識到生命的過程，而且對于臨床應用中疾病的診斷、進展預測與治療也十分重要。自人類基因組圖譜繪制完成后，生命科學就已經進入了后基因時代，對于DNA 序列的測定與遺傳信息的解釋也已經轉移到了分子水平上的研究。從而，在分子水平闡述生命的奧秘，尋找診斷和治療疾病的新方法與新途徑。發展至今，大量的基因組與蛋白組的研究項目已成為了生命科學研究中的焦點。然而，基因位于

10、染色體上，基因表達而產生的蛋白質是在核糖體上合成的，生命體中的各種生化反應也都是在細胞中完成的。脫離了細胞而進行 DNA、蛋白質變化的研究，獲得的數據往往與實際情況有較大差異?？梢哉f，基因組只是定義了生物體的遺傳潛力，但不能完全反映出環境因素改變時細胞整體功能性的改變，而細胞是生物體表現功能的基本單位。因此，對 DNA 與蛋白質的研究必須整合到細胞中進行，把生命過程中從基因到蛋白質的有關信息和細胞的結構與功能及細胞間的相互聯系關聯起來1，即只有在細胞層次上對 DNA 和蛋白質等生物分子進行的研究，才能夠系統地、全面地認識它們的功能以及相互作用。由于在生命體中的各項活動都離不開細胞，在細胞層次上

11、對生物分子的研究已然成為新的研究熱點。但是，研究層次的不同對技術手段與實驗方法的要求也是不同的。目前，雖然蛋白質芯片、DNA 芯片等技術已趨于成熟，但其均脫離了細胞，無法適用于細胞檢測。因此，研究生物分子在細胞水平上的實時檢測技術更是刻不容緩。常熟理工學院畢業設計（論文）71.1.2 細胞檢測技術的研究現狀從人類首次用顯微鏡觀測到細胞到現在，cell biology 的發展離不開新的檢測技術，若沒有技術層面上新的突破，對細胞研究的進展只能是極其緩慢并且十分困難的?？v觀歷史，細胞生物學的萌芽得益于光學顯微鏡的發明，隨之各種各樣的顯微鏡的相繼問世又進一步推動了細胞生物學的發展，使之進入了更深層次的

12、研究。 而如今細胞生物學的研究早已發展到了分子階段，迫切需要細胞分子檢測技術的支持，對精度的要求也急劇提高。隨著細胞生物學的發展，細胞的檢測方法不再停留在光學顯微鏡階段，而是向多元化發展。按不同檢測方式所適用的范圍來劃分，細胞檢測技術可分為幾個方面：細胞的形態與生理功能方面，細胞接受外界的刺激方面，細胞內蛋白質之間的相互作用方面，細胞膜上的生理活動方面。1.1.2.1 細胞形態與生理功能檢測人類對細胞最初的認識僅僅停留在形態結構上，但隨著電子顯微鏡的問世，cell biology 的發展又邁出了重要的一步。人類對細胞的研究不再局限于光學顯微鏡時代形態上的構造，而由顯微結構過渡到亞顯微結構，隨后

13、對細胞的功能性研究也開始起步，隨著研究的深入，又推動了新的檢測技術與儀器的發展。1.1.2.1.1 流式細胞儀細胞生物學早期的研究重心主要放在對細胞的分類與細胞形態結構的描述，傳統的光學顯微鏡無法快速檢測細胞的亞顯微結構，也不能夠便捷地得到細胞分類或細胞周期變化2的各種參數。為了克服傳統光學顯微鏡的不足，于是便研發出了流式細胞儀（FCM） 。流式細胞儀的出現始于上世紀 70 年代，并在多個領域已經得到了廣泛的應用，并向儀器功能增強化、分析快速化、使用智能化等方面發展。流式細胞儀是通過檢測分析被熒光染色的細胞在不同散射角度的光散射光信號和熒光信號（熒光強度） ，從而獲取細胞種類與數量等信息。常熟

14、理工學院畢業設計（論文）81.1.2.1.2 原子力顯微鏡隨著人類對細胞的研究發展到微結構層次，對分辨率的要求進一步提高，原子力顯微鏡（AFM）便應運而生。AFM 具有原子級別的分辨率4，它主要通過對微弱力極其敏感的微懸臂上的針尖掃描待測樣品時微懸臂隨樣品表面形貌上下起伏，激光照射在微懸臂背面，隨著微懸臂的上下浮動，反射光也隨之偏移，通過分析檢測器獲得的反射光光斑的偏移從而獲得樣品表面的形貌信息。AFM 應用在細胞研究項目上，不僅能夠觀測到細胞膜表面非常細微的結構，并且對膜的粘性以及膜上生物分子的識別等研究也同樣適用。原子力顯微鏡能夠提供樣品的三維表面圖且不需要對樣品進行特殊處理，但由于成像原

15、理的特殊性，原子力顯微鏡對樣品細胞的穩定性要求較高。AFM 通常有 3 種工作模式，非接觸模式在室溫大氣下難以實現，而接觸模式與敲擊模式在掃描過程中又有可能損傷探針與待測細胞。因此，原子顯微鏡在細胞檢測的應用中也存在著局限性。1.1.2.1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡熒光標記法常用于細胞生理活動的研究中，并使用熒光顯微鏡來觀測。隨著共振能量轉移技術的逐漸成熟，再加上熒光蛋白標記技術的發展，激光共聚焦掃描顯微鏡（LCSM）成為了細胞形態結構、細胞生理活動研究的利器。LCSM 能夠顯示出細胞的立體結構，并且避免了光散射導致的圖像信噪比低的現象，使圖像的分辨率得以提高。LCSM 的基本結構如圖 1.1

16、 所示，其主要由激光發射器、物鏡、掃描模塊與圖像處理模塊組成。LCSM 的缺點有：需要對待測細胞進行熒光標記，而激光又會快速漂白熒光蛋白5；熒光信號的捕獲需要低噪音光電倍增管按點逐一進行，造成成像時間長且無法實時監控的缺點；激光照射在整個細胞上，但只有很少一部分的熒光受激發后被采集到，從而熒光信號的捕獲效率低下。由此可見，LCSM 對細胞的檢測難以做到實時的 3D 顯示。常熟理工學院畢業設計（論文）9 圖 1.1 LCSM 的基本結構圖1.1.2.1.4 掃描電化學顯微鏡在對細胞的研究中，不僅用到了光學成像法，同時也用到了電化學檢測法。掃描電化學顯微鏡（SECM）與 AFM 不同，它是通過使用

17、電化學的原理并能夠對單個細胞進行實時監測的儀器。SECM 對單個細胞的的檢測原理如下圖 1.2所示，它具有一個超微電極（UME）作為檢測時的探針，當探針離細胞表面非常近時，UME 上便產生了電流的變化，進而可以反映細胞的形貌與各種生理過程等。Ptsi gnl e cel lU M Ee-O2gl ucose+H2O2G OXdi f f usi ongl ucosegl ucosegl ucosePet ri di shEU M E=+0. 6Vvs. Ag/ AgC l , 3 M KC LA)Ptsi gnl e cel lU M Ee-O2l act at e+H2O2LOXdi f f

18、 usi onl act at el act at el act at ePet ri di shEU M E=+0. 6Vvs. Ag/ AgC l , 3 M KC LB)圖 1.2 掃描電化學法原理圖6常熟理工學院畢業設計（論文）101.1.2.2 細胞接受外界刺激檢測當細胞受到化學藥劑、生物分子等外界刺激時，它便會發生一些生理變化，例如細胞內的分子運動、細胞的形態變化等。而這些變化是可以通過發光、顏色變化、電位變化等特征來觀測。1.1.2.2.1 電阻抗法電阻抗法最早被運用于細胞增殖、細胞形變與運動的研究中，它是一種以阻抗特性為檢測依據的電化學檢測方法。但隨著技術的成熟化，電阻抗法被運

19、用于更多的生物細胞學的研究中，例如檢測細胞的新陳代謝、細胞的應激反應等。電阻抗檢測的檢測過程一般為：將待測細胞偶聯于工作電極上以增加電極阻抗；在適宜的頻率下，檢測對電極與工作電極之間的阻抗；解析電信號從而取得所需信息。電阻抗法的檢測環境必須在溶液中，但溶液中電解所產生的離子以及其它的雜質又會干擾檢測，使檢測的可靠性下降。因此，細胞檢測中使用電阻抗法同樣也具有一定的局限性。1.1.2.2.2 共振波導光柵檢測法CellEvanescent waveIncoupling lightOutcoupled lightG rat i ngW avegui deSubst rat e圖 1.3 RWG 檢

20、測細胞的原理圖光學檢測法因具有比電化學法更強的抗干擾能力、更高的分辨率而倍受青睞，各種光學檢測法更是層出不窮。常熟理工學院畢業設計（論文）11在眾多新穎的光學檢測法中，共振波導光柵檢測法（RWG）是一種利用衍射光柵（Grating）使光與光波導（Waveguide）耦合共振產生隱失場（Evanescent wave）進而實現檢測折射率變化的檢測方法。RWG 檢測法無需標記，就可獲取多項檢測數據，例如發射強度、共振角以及共振峰的寬度等。經過分析這些檢測數據，便能得到細胞受激后胞內分子的遷移情況，如圖 1.3 所示細胞受 EGF 刺激因子作用。1.1.2.3 細胞膜上的生理活動檢測1.1.2.3.

21、1 全內反射熒光顯微鏡C el lG l ass surf acen1n2Evanescent f i el dd=100-300nmO bj ect i ve l ensLaser beam圖 1.4 TIRFM 檢測原理圖全內反射熒光顯微鏡5（TIRFM）的檢測原理圖如圖 1.4，它通過隱失場激發出的熒光對細胞膜表面進行成像，它的激發深度能達到。相比之下，100nmLCSM 的深度范圍內，因此，利用 TIRFM 對于細胞膜上生理活動500800nm:進行檢測時信噪比較高。另一項對細胞研究具有重要意義的是，利用 TIRFM 對于細胞膜上生理活動進行檢測還能有效的減少光漂白與光損害。利用 TI

22、RFM 對細胞膜的檢測最大的優點是，形成圖像的過程較簡單速度較快且不需要進行掃描。TIRFM 雖然在成像時具有一大優勢，但其由于要對細胞熒光標記也會在一定程度上對細胞造成功能性的影響。1.1.2.3.2 光子晶體檢測法如上文所訴，熒光標記法雖然比較靈敏，但其也可能會影響細胞的功能。為了彌補這一缺陷，光子晶體檢測法誕生了。光子晶體有著能產生 Bragg 衍射常熟理工學院畢業設計（論文）12的特殊性，而光子晶體檢測法主要的檢測原理就在于這一點，因此這種檢測方法并不需要進行標記，其基本過程如圖 1.5 所示。光子晶體檢測雖然不需要對細胞進行標記處理，但其設計的過程需要復雜的理論推導與計算。再加上光子

23、晶體的制作也比較復雜，這大大限制了它的廣泛應用。 - 圖 1.5 光子晶體檢測基本過程1.1.3 細胞檢測技術存在的問題根據前文所述，歸納出多種常用細胞檢測技術所使用的范圍及其優劣對比，如表 1.1 所述。表 1.1 細胞檢測技術的比較5 / FCM - AFM 1. 2. LCSM Ca2+ 1. 2. 3. SECM TIRFM 1. 2. 1. 2. 1. 2. 1. 2. RWG 1. 2. 3. 1. 2. 3. 由于細胞檢測具有比基因檢測、蛋白質檢測更為嚴格的檢測條件，細胞檢常熟理工學院畢業設計（論文）13測的挑戰更是不容小覷。細胞檢測現階段存在的問題主要有以下幾點：1.細胞種類多

24、、尺寸差異大、特性各有不同。同種細胞還可細分為多種類型，即使是相同種類的細胞在形態特征上也存在差異，而且在不同的細胞周期也具有著不同表型。因此，為了保證檢測的可靠性，在細胞檢測時必須根據所測細胞類型選擇相適應的模式系統，特殊情況下必須對細胞周期同步進行。2.在多細胞檢測群體效應時，要求細胞要均勻覆蓋在傳感器上。3.在長時間的細胞檢測中，細胞易失去活性，從而影響檢測。因此，必須要盡量縮短細胞的檢測時間或者給以合適的細胞生存環境來保持細胞活性。4.細胞膜是具有一定流動性的，而細胞的狀態與環境溫度往往會影響其流動性，使檢測難度加大。不僅如此，細胞內部也會發生很多的生理過程，使干擾檢測信號。因此，為了

25、保證實驗的穩定性，并需要設立嚴格的對照組實驗，來排除其它干擾因素對檢測產生的影響。5.在細胞的研究中，為了全面地了解細胞的生理過程并能夠做到定量分析，實時地監測各類相關參數顯得很有必要。綜上所述，細胞檢測的無損化（無需標記） 、高通量、高靈敏、實時特性是當今細胞生物學研究的必然趨勢。而基于表面等離子體共振（SPR）的傳感器則是一種極具分子間相互作用檢測潛力的新穎光學檢測方法。因此，本文將SPR 傳感技術與細胞檢測技術相結合，試圖找到新的方法來檢測細胞上的分子反應，從而為細胞生物學的研究創造有利條件。1.2 基于基于 SPR 傳感的細胞檢測傳感的細胞檢測1.2.1 SPR 現象與傳感原理SPR

26、是當入射光由光密介質入射到光疏介質并且入射角大于臨界角時所激發的光學現象10。當光疏介質是復介電常數的金屬時，并且在適宜的波長、入射角度、耦合方式、金屬薄膜厚度等條件下，入射光從光密介質（玻璃）與金屬界面發生全反射現象時會產生隱失場，從而使金屬表面自由電子發生振動，表面等離子體波便在待測介質-金屬界面產生，這種現象即是 SPR 現象。表面等離子體波，英文縮寫為 SPW，它是一種沿待測物質與金屬的界面傳播的，并常熟理工學院畢業設計（論文）14呈指數方式減弱的 p 偏振電磁波。當發生 SPR 現象時，激發波幾乎所有的能量都將被轉化成 SPW 的能量，從而導致反射光光強大幅衰減。棱鏡材料、金屬膜材料

27、與厚度一旦確定后，SPR便會隨著金屬膜表面介質的折射率的變化而變化。 - 121212 SPW圖 1.6 SPR 生物芯片的原理圖當待測樣品發生變化時，反射光的光強將會產生顯著的改變，因此，SPR檢測靈敏度很高。 如圖 1.6 所示，以免疫反應為例，含有待測抗體的溶液流經芯片金屬層表面，當抗原與抗體發生特異性結合時，金膜-待測介質界面的折射率將變大，從而使共振角（共振信號）變化。當發生 SPR 現象時，反射光光強與相位均會發生很大的變化，實時記錄并分析共振信號的變化，便可定性定量的了解反應進行狀況。如圖 1.6 所示的是 SPR 信號的一條典型曲線，它反映了一些生物分子的特異性結合、解離等動態

28、過程，此種方法有著靈敏、實時、無需標記等優勢。常熟理工學院畢業設計（論文）15 圖 1.7 SPR 信號的典型曲線71.2.2 基于 SPR 傳感的細胞檢測技術概述SPR 傳感比較適合檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，但其在細胞檢測上的應用還在起步階段。SPR 傳感與 RWG 具有類似的檢測原理，檢測深度都能達到百納米級，并且適用于檢測細胞膜上發生的分子反應。不同之處在于發生SPR 現象時，SPW 的場強要比普通隱失場的場強要高出大約個數量級，由12:此可見，SPR 傳感的檢測信噪比更高。SPR 傳感的檢測深度會隨著激發波長的增加而增加，而且只要能選擇合適的激發波長就可對整個細胞進行檢測。目前對

29、于在細胞檢測研究方面的 SPR 傳感大致可分成：1.紅光 SPR 傳感、2.近紅外光 SPR 傳感、3.SPR 增強型 TIRFM5。紅光 SPR 傳感紅光 SPR 傳感器的檢測深度一般在之間，如圖 1.8 所示，200300nm:等人根據不同的 SPR 共振角度，從而獲得細胞膜特定位置和粘Karl -F. Giebel附（Focal contact）基底間的距離以實現對細胞表面粘附情況的研究。常熟理工學院畢業設計（論文）16圖 1.8 細胞粘附情況8近紅外光 SPR 傳感近紅外光 SPR 傳感檢測與紅光 SPR 檢測相比具有很多優勢：1.更深的檢測深度、2.更銳的共振峰、3.在傳感層具有更高

30、的場增強效果等。等通過近紅外波長掃描法利用傅氏變換紅外光譜儀、SPR 傳Anthony G.Frutos感器這兩種儀器成功檢測了超薄膜，并且論證了靈敏度與紅光 SPR 傳感在同一級別。由于檢測深度在亞微米級的紅光 SPR 傳感與尺寸大小在微米級的細胞不相匹配，傳統的紅光 SPR 傳感限制了細胞檢測。然而，等在細胞檢測Roy Ziblat研究中運用了 FT-SPR 技術成功檢測了細胞膜中的磷脂膜，而且使檢測深度也加深至大約。10 m一方面，近紅外 SPR 的確有著較深的檢測深度；但另一方面，較深的檢測深度同樣導致了一個問題：得到的信號是細胞內所有生理活動信號的混合，難以分離出特定生理活動的特定信

31、號。SPR-TIRFMTIRFM 所激發的隱失場能量比較弱，從而導致激發出的熒光強度也比較弱直接影響到了檢測，而 SPW 場強比 TIRFM 所激發的隱失場大個數量級。12:因此，利用 SPW 場比隱失場所激發的熒光強度也會更強。結合 SPR 靈敏度與 TIRFM 的優點，SPR-TIRFM 應運而生，從而可以更加靈敏地檢測細胞膜上的生理活動。等運用共光路相移干涉儀結合Ruei-Yu HeSPR 的方法，即 SPR-TIRFM，檢測了細胞的粘附與運動特性，并且進行了對細常熟理工學院畢業設計（論文）17胞膜的成像。如圖 1.9 所示為分別采用 TIRFM 與 SPR-TIRFM 技術得到的細胞膜

32、表面熒光圖，使用 SPR-TIRFM 技術所得的右圖具有更高的熒光強度。TI R FMSPR -TI R FM圖 1.9 TIRFM 與 SPR-TIRFM 成像比較9SPR-TIRFM 技術雖然能得到更高的熒光強度，但其依舊要對樣品進行熒光標記處理，檢測信號依據熒光強度，從而不能避免熒光標記的缺點。SPR-TIRFM 雖然也利用到了 SPW 激發熒光團，但其并未使用到 SPR 無需標記的特點。1.2.3 SPR 傳感用于細胞檢測的優勢及瓶頸問題SPR 傳感用于細胞檢測的優勢：1.不需要對樣品進行標記從而簡化了操作過程；2.檢測靈敏度高；3.可進行實時檢測；4.根據不同的檢測對象選擇不同波長的

33、激發光，可實現細胞中各種生理過程的檢測。SPR 傳感用于細胞檢測的瓶頸問題：1.細胞的種類和形態各不相同，其尺寸大小在之間。根據上文1m100m:所述，不同的入射波長激發不同的 SPW 穿透深度即不同的檢測深度。所以，需要使用不同的入射波長來匹配不同的細胞檢測。2.活細胞處于不同的細胞周期，并且其狀態也會發生改變。因此，為了提高檢測的可靠性，避免其他干擾因素，在檢測時需要進行對照組實驗。3.SPR 傳感檢測細胞，獲取到的信號是所檢測區域綜合效應的信號，為了分離出某個特定的生理活動的信號，還需要通過復雜的算法解析獲取的總信號。常熟理工學院畢業設計（論文）181.3 課題內容和意義課題內容和意義目

34、前，雖然細胞檢測技術眾多，但其大多要么需要對樣品細胞進行熒光標記，要么不具備檢測的實時性。然而，SPR 技術同時有著無需標記、樣品無損化、高通量、可實時檢測與高靈敏的特點，在細胞檢測方面有著重要意義。當前，SPR 傳感檢測細胞的研究項目并不多，而且專門用于 SPR 檢測細胞的商業檢測儀器未出現。因此，研究適用于細胞檢測的 SPR 技術十分迫切。本課題針對前文所述 SPR 傳感系統應用于細胞檢測方面的瓶頸問題，提出了一種解決方案。目前常用的棱鏡傳感系統是克萊舒曼型棱鏡傳感系統，通常有 5 層，為了方便研究可將其簡化為三層，即：第 0 層是高折射率的棱鏡層，第 1 層是金屬（通常為金或銀）薄膜層，

35、第 2 層是待測物質的傳感層，如圖1.10 所示。 012 圖 1.10 三層結構的 SPR 傳感模型本課題將會利用 Matlab 軟件對基于角度調制的三層結構 SPR 傳感模型的各參數進行數值仿真，得出各參數之間的相互關系。進而改變模型的各參數，使其在中紅外波段形成最強共振吸收峰（SPW），激發波長的增加可以增加檢測深度，更準確可靠的完成一些與 SPW 相匹配的生物細胞的測量。常熟理工學院畢業設計（論文）19第二章 SPR 傳感用于細胞檢測的理論分析2.1 棱鏡耦合式棱鏡耦合式 SPR 傳感模型傳感模型SPR 傳感具有多種耦合方式，由于不同的耦合方式有著不同的適用范圍，對于細胞檢測方面，本文

36、針對棱鏡耦合式 SPR 傳感模型進行研究與分析。 012(a)Otto 012(b)Kretschmann 圖 2.1 棱鏡耦合結構如圖 2.1（a）所示的 Otto 型棱鏡耦合結構，在金屬膜與棱鏡底部存在一定厚度的空隙，這個空隙有入射光波長大小的厚度。待測物質就置于此空隙中，然后通過改變空隙或者金屬膜的厚度來激發 SPW。因為空隙一般也就幾百納米，所以控制難度較大并且制作也不便，在實際的研究中很少用到 Otto 型結構。如圖 2.4（b）所示的是克萊舒曼型結構，與 Otto 型最大的區別是其結構中金屬薄膜層與光學棱鏡底部緊密貼合，而待測物質是被放在金屬膜的另一側。通過控制光線入射角大小、波長

37、大小的方式來激發 SPR。若入射光線的入射角 大于零度且小于臨界角，則會發生折射現象。為了避免這一現象的產生通常要做到兩點：入射光線垂直于棱鏡表面，使用半圓柱形棱鏡或者等腰三角形棱鏡11。半圓柱形的棱鏡可確保以任意角度指向圓心的入射光線均與界面垂直，且光線進入棱形前后的角度不會發生改變。對于基于棱鏡耦合的 SPR 研究，棱鏡的折射率與待測介質的折射率比值越高，傳感器的靈敏度也就越高。因此，提高靈敏度的一種方法是選用折射率高的材料來制作棱鏡。產生 SPR 現象的條件：光波與 SPW 波矢相互匹配，即滿足條件： （2-si nR ei nkk0常熟理工學院畢業設計（論文）201）上式中，為激發光波

38、矢，為激發光的入射角，為 SPW 波矢。0kink因為光從空氣直接照射到金屬表面，光波與 SPW 不法波矢匹配，所以必須要通過耦合的方式，從而使光波與 SPW 波矢能夠匹配。如上文所述， ，本文選擇 Kretschmann 型結構，通過入射角 in的改變，使光在棱鏡-金屬界面產生全內反射現象，由消逝波激發金屬-傳感界面附近的自由電子的振蕩，從而產生 SPR現象，此時消逝波的波矢為： （2-2）02sinsinzininkk在實際的使用中 Kretschmann 型通常有 5 層（0 層為高折射率的棱鏡層，1層為粘附層，2 層為金屬層、3 層為調制/增敏層、4 為環境介質） ，為了方便分析，故簡

39、化為 3 層結構。如圖 2.5 所示，0 層為棱鏡層，1 層為金屬層，2 層為傳感層。012xyz 如圖 2.5假設傳感層與金屬層均為半無限大平面，SPW 波矢可表示為：sk （2-3）12122sk 上式中，為金屬的介電常數，為被測樣品的介電常數。由于金屬層是12具有一定厚度的，所以的波矢只能近似等于為公式（2-3）右式。sk當消逝波與 SPW 達到共振時，即時zskk整理可得： （2-4）si ns 1212常熟理工學院畢業設計（論文）21入射角s為共振角。SPW 與消逝波相互作用，激發等離子體共振，入射光的能量絕大多數都被轉移到了 SPW 上，反射光光強也因損失絕大多數能量而急劇下降。通

40、過分析反射光的光譜便能找出共振峰壑。在三層介質模型中，光強總反射率 R、反射光復反射系數 r0,2可用下列式子表示： （2-5）20.2Rr （2-6）0,11,2110,20,1 1,211exp 2 -11exp 2xxrrjd krjr rjd k（） （2-7）1,11- 0,1iii iiiri（） （2-8） 0,1,2iixiik（） （2-9）222- 0,1,2xiizkki（）上式中，ri,i+1表示為 p 偏振光在兩個相鄰介質層間反射的復反射系數，kxi表示為光波光波在穿越第 i 層介質時的波矢，kz表示為波矢在棱鏡中的 z 分量，i表示為第 i 層膜的介電常數，d1表示

41、為金屬層的厚度， 表示為入射波長。2.2 SPW 的特性的特性SPW 在傳播過程中的衰減特性與 SPR 傳感有著十分密切的關系。為了找到SPR 傳感用于細胞檢測方面的充足理論依據，所以首先要分析 SPW 的相關特性。2.2.1 SPW 的傳播特性2.2.1.1 橫向傳播特性由公式（2-3） ，表面等離子體波的波矢與金屬的介電常數密切相關，而金屬的介電常數為復數。激發 SPR 現象的金屬薄膜層的復介電常數實數部分為負數。當實部的絕對值遠大于虛部的絕對值即時，表面等離子體波可mmmm:常熟理工學院畢業設計（論文）22表示為： （2-19）322222()mdmmdmdmmdii 如圖 2.9 所示

42、的是在傳感層中表面等離子體波的電場強度分布圖，Z 軸為橫向，表示 SPW 的傳播距離，X 軸為縱向，表示 SPW 的穿透深度，顏色越深表示場強越大。從圖中可以看出：表面等離子體波以一點為中心并向四周傳播，且傳播距離越長場強越弱。 xxz圖 2.9 在傳感層中表面等離子體波的電場強度分布5如圖 2.10 所示的是表面等離子體波的傳播長度與激發波長的關系圖（選用金膜，傳感層介電常數） ，由圖可知，傳播長度隨著波長的增大而增21.33d大。激發波長為、時，傳播長度分別為，其長度超650nm780nm20 m55 m過了一般動物細胞的直徑，難于檢測單個細胞，但可以檢測群體細胞。圖 2.10 表面等離子

43、體波的傳播長度與激發波長的關系52.2.1.2 縱向穿特特性如圖 2.11 所示的是入射光法線上場強與深度的關系圖，由圖可知，表面等離子體波在金屬-傳感層界面附近的場強最大，但在傳感層中隨著深度的增加場常熟理工學院畢業設計（論文）23強呈指數衰減，穿透深度即為 SPR 傳感檢測范圍（金屬層中場分布復雜且與SPR 傳感關系不大而不做分析） 。圖 2.11 入射光法線上場強與深度的關系52.2.2 SPW 穿透深度與激發波長的關系激發波長是 SPR 傳感模型眾多參數中極為重要的一個，其大小會直接影響到金屬膜、棱鏡、待測介質、的介電常數、SPW 的場分布等。表面等離子體波在傳感層中的穿特深度可用下面

44、的式子表示： （2-20）1/24212ReddefdefmLnn上式中的為傳感層等效折射率。如圖 2.12 所示的是波長與穿特深度的defn關系圖（選用金膜，傳感層等效折射率） ，由圖可知，激發波長越長，1.33defn穿特深度越深，即檢測范圍越深。因此，為了適應不同檢測深度的要求可以選用不同的激發波長。常熟理工學院畢業設計（論文）24圖 2.12 波長與穿透深度的關系圖52.3 SPR 細胞檢測模型的建立及分析細胞檢測模型的建立及分析2.3.1 細胞的等效折射率SPR 傳感檢測細胞時，生物芯片的表面可看作是一層由細胞群均勻排列分布的介質層（傳感層） ，傳感層的折射率取決于細胞的折射率。細胞

45、種類眾多、結構復雜，不同種類以及處于不同細胞周期的同類細胞的折射率也各不相同，各學者所測定的細胞各部分的折射率也不盡相同。其中的一組數據見表 2.1，表中數據來源于文獻12。表 2.1 細胞各部分折射率類別細胞外環境細胞膜細胞質線粒體細胞核折射率1.351.461.371.41.39胞膜的厚度僅有，由于內的近膜區域（SPR 傳感檢測區域）主要510nm:是細胞質，胞內折射率可認為是，胞外折射率則為。1.371.352.3.2 SPR 細胞檢測的物理模型由上文所述，不同波長的檢測深度不同，而細胞一般的大小為，1100 m:因此可選用不同波長的激發波來滿足不同細胞的檢測要求。常熟理工學院畢業設計（

46、論文）25SPR 傳感器最常用的激發波長為，其檢測深度與細胞的尺寸相差較650nm遠，只能檢測到靠近金屬層的細胞部分結構（近膜區域） 。若只是檢測細胞的群體變化時，例如細胞形態變化、細胞受激反應等生理活動，可將傳感層近似看作是一層均一的且各向同性的介質層，傳感層折射率相同的均一介質模型適用。而倘若要區分總的趨勢信號中的特定信號時，則均一介質模型不再適用，需要引入新的模型，即分層介質模型。其中，傳感層 1為細胞膜外層，傳感層 2 為胞內近膜層。2.3.3 SPR 傳感的靈敏度分析2.3.3.1 均一介質模型的靈敏度分析xyzmd+ dLd 圖 2.11 均一介質模型均一介質模型的靈敏度可用下式表

47、示： （2-21）333Re1 exp2ddefefddLnsnk n其中，為 SPW 的穿特深度。2kdL2.3.3.2 分層介質模型的靈敏度分析xyzmd1+ d1 1d2+ d2l 2Ld圖 2.12 分層介質模型分層介質模型的靈敏度可用下式表示： （2-22）31331Re1 exp2defefddeflnsnk n （2-23）32332Reexp2defefddeflnsnk n常熟理工學院畢業設計（論文）26第三章 SPR 細胞檢測模型的設計3.1 Kreschmann SPR 傳感模型的數值模擬傳感模型的數值模擬模擬時所用到的公式主要如下（公式（2-9） 、 （2-10） 、

48、（2-11）具體見 2.1.5 節）： （3-1）20,11,21x10,1 1,21x1r +r exp 2jdR=11+r r exp 2jdkk （j =）通過單一變量法，分別對各參量對反射率的影響進行仿真。不同的待測物質對反射率的影響根據前文所述的理論模型，假設棱鏡的折射率 n0=1.55，取入射波長=650nm，選用銀膜，介電常數 1=-17.6+0.5i，膜的厚度 d1=50nm，待測物質的折射率分別為 1.31、1.32、1.33、1.34、1.35，使用 MATLAB R2012b 進行仿真。565860626466687072747600.10.20.30.40.50.60.

49、70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入 n2=1.31n2=1.32n2=1.33n2=1.34n2=1.35圖 3.1 不同待測物質的入射角與反射率關系如圖 3.1 所示的是不同待測介質的 SPR 曲線，待測介質折射率在 1.33 左右。從圖中可看出，不同的待測介質的反射率都存在一個極小值，它所對應的即是共振角。待測物質的折射率變大時，曲線向右偏移，即待測物質折射率越大共振角越大。棱鏡折射率對反射率的影響常熟理工學院畢業設計（論文）27假設待測物質為純凈水，折射率 n2=1.33，取入射波長 =650nm，選用銀膜，介電常數 1=-17.6+0.5i，膜的厚度 d1=50nm，不同棱

50、鏡的折射率分別為1.5，1.6，1.7，1.8。同樣采用固定波長 ，改變入射角 的方法進行仿真模擬。4651566166717600.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入 n0=1.5n0=1.6n0=1.7n0=1.8圖 3.2 不同棱鏡的入射角與反射率關系如圖 3.2 所示的是不同棱鏡的反射率與 p 偏振光入射角的關系。從圖 3.2 中可看出，當待測介質固定時，入射介質（棱鏡材料）折射率變大時，曲線向左偏移，共振峰越銳， SPR 現象比較明顯。金屬膜厚度對反射率的影響假設采用折射率 n0=1.55 的棱鏡，待測物質為純凈水，折射率 n2=1.3

51、3，取入射波長 =650nm，選用銀膜，介電常數 1=-17.6+0.5i，不同膜的厚度分別為30nm，40nm，50nm，80nm。采用與上述相同的方法進行仿真模擬。常熟理工學院畢業設計（論文）2860626466687000.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入d1=40nmd1=30nmd1=50nmd1=80nm圖 3.3 不同厚度金屬膜的 SPR 曲線如圖 3.3 所示的是不同厚度金屬膜的 SPR 曲線。由圖可知，當金屬膜的厚度小于 50nm 時，膜越厚 SPR 現象越劇烈。但當金屬膜的厚度時，吸50dnm收峰逐漸變得不明顯22。3.2

52、金屬膜材料與厚度的選擇金屬膜材料與厚度的選擇3.2.1 金屬膜材料的選擇不同材料的金屬膜有著不同的介電常數，在其它條件相同的情況下，不同性質的金屬膜所引起的 SPR 曲線差異較大。因此，合適的金屬材料的選擇對 SPR 傳感細胞檢測具有重要的意義。選擇 Kretschman 型 SPR 傳感模型，如圖 2.5 所示。用 Matlab 軟件分別對 Au 膜、Ag膜角度調制型 SPR 傳感器進行數值模擬，其中的各項參數為：入射波長；金屬=600nm膜的厚度為 50nm；Au 膜與 Ag 膜的介電常數分別為 Au=-8.77+1.37i20，Ag=-14.1+0.45i20；棱鏡層折射率 n0=1.5

53、49；待測介質的折射率 n2=1.329；入射角的范圍為 4989。常熟理工學院畢業設計（論文）2950556065707580859000.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入 入入 入 入AgAu圖 3.4 Ag 膜與 Au 膜模擬所得的 Ag 與 Au 膜的入射角-反射率曲線如圖 3.4 所示。由圖可知，在相同情況下，Ag 膜的半峰寬度小于 Au 膜的半峰寬度，即 Ag 膜的共振峰更銳，選用 Ag 膜具有更高的靈敏度。3.2.2 Ag 膜厚度的選擇在 SPR 傳感器中，不同的入射波長對應各自適合的金屬膜厚度，合理的金屬膜厚度能增強 SPR 現象使靈敏度提高

54、，上文所述的入射波長 600nm 時 Ag 膜所對應的最適厚度 50nm 已不再適用，需要重新選擇金屬膜的厚度。中紅外波段的波長為，取入射波長，銀膜的介電常數 1=-35 m:4 m834+48.8i20，采用折射率 n0=1.6 的棱鏡，待測物質為細胞，近似取細胞質的折射率，不同膜的厚度分別為，進21.37n 20nm25nm30nm40nm50nm行數據模擬，獲得角度調制型 SPR 曲線，如圖 3.5 所示。常熟理工學院畢業設計（論文）3058.958.955959.0559.159.1559.259.2559.300.10.20.30.40.50.60.70.80.91入 入 入 /入

55、入入 入 入d1=20nmd1=25nmd1=30nmd1=50nmd1=40nm圖 3.5 波長為 4m 時不同銀膜厚度的 SPR 曲線分析圖 3.5 可知，在中紅外波段，銀膜的厚度為 25nm 左右且入射角度在59.05時，SPR 現象最為強烈。處于共振最強位置時，銀膜的厚度增加或者減少都會導致最小反射率的增大即共振現象減弱。對銀膜的厚度與反射率的關系進 一步分析，在以上基礎上固定入射角度為59.05在銀膜厚度為 0100nm 范圍內的反射率進行數據模擬，模擬結果如圖3.6 所示。由圖可知，在 Ag 膜厚度為 27nm 時，反射率達到最低值為0.004709。因此，進一步優化入射波長為時

56、Ag 膜 SPR 細胞檢測模型的4 mAg 厚度為 27nm。010203040506070809010000.10.20.30.40.50.60.70.80.91X: 27Y: 0.004709入 入 入入 入 入 入 /nm圖 3.6 銀膜厚度與反射率的關系常熟理工學院畢業設計（論文）313.3 Ag 膜的制備工藝膜的制備工藝采用磁控濺射（MS）技術制備 27nm 厚度的 Ag 膜，基底選用與棱鏡折射率相同的玻片，鍍膜前用超聲波對玻片進行清洗，鍍膜時玻片溫度與室溫相同，選用純度的 Ag 靶材與 Ar24。99.99%選用直流電源，鍍膜真空腔內真空度為。電壓為，電流為-31.8 10 Pa3

57、20V，沉積速度為25。27nm 的 Ag 膜約用 13.1min，具體的 Ag 膜0.05A2.06nm/min的厚度可使用來臺階儀來測定。Alpha-Step 5003.4 Ag 膜膜 SPR 細胞檢測模型的可行性分析細胞檢測模型的可行性分析細胞的尺寸大小在之間，傳統的紅光 SPR 傳感器的檢測深度1m100m:僅僅在亞微米級，無法檢測整個細胞。如 2.2.3 所述，激發波長越長，檢測深度越深。因此，選用更長的激發波長來適應細胞級的檢測深度。中紅外波段的，根據公式（2-20）可算出 Ag 膜 SPR 傳感在入射波長為紅外波段時的35 m:檢測深度大約在 5.51m15.37m 之間（入射波

58、長在 3m、4m、5m 時 Ag膜的介電常數分別為-471+20.6i、-834+48.8i、-1310+95.6i） ，而一般細胞的半徑在 0.5m15m 之間。因此，中紅外波段所對應的檢測深度基本符合細胞檢測深度的要求。實際的應用不僅需要理論上的實現，更需要加工工藝的支持，金屬膜越薄對加工工藝的要求越高。制備 27nm 厚度銀膜，可采用磁控濺射等技術都能使銀膜生長均勻。綜上所述，Ag 膜 SPR 傳感 SPR 細胞檢測模型在理論與技術上均能實現。常熟理工學院畢業設計（論文）32第四章第四章 總結與展望總結與展望本論文主要通過文獻綜述、理論分析、Matlab 數據仿真模擬等方法，對傳統的基于

59、角度調制的 Kretschmann 型 SPR 傳感模型進行綜合分析，并通過優化模型的各參數，使其能在中紅外波段對細胞進行檢測。主要研究內容如下：第一章（緒論部分） ，對用于細胞檢測方面的多種檢測儀器與技術的特點進行了闡述與對比，并分析了 SPR 技術應用于細胞檢測領域的優勢、現狀與瓶頸。第二章（理論分析部分） ，論述了 SPR 現象的產生條件，著重對 3 層結構的Kretschmann 型 SPR 傳感模型進行分析，構建了 SPR 細胞檢測模型。第三章（模型設計部分） ，首先，基于第二章 3 層介質模型光強總反射率公式，采用單一變量法，對不同待測物、不同材質的棱鏡、不同金屬膜厚度情況的 SP

60、R 傳感模型分別進行了 Matlab 數據模擬，得出部分參數與總反射率 R 的相互關系。其次，使波長位于中紅外波段來增加檢測深度，并調整模型其它參數使其形成最強共振吸收峰（SPW）。最后，對此 SPR 傳感細胞模型進行了可行性分析。隨著 SPR 細胞檢測理論與技術的發展，單一波長的 SPR 難以實現細胞的分層檢測，多波長的 SPR 細胞分層檢測技術將得以發展。隨著各種技術的不斷發展與融合，SPR 細胞檢測的后續研究可與 MEMS 工藝、納米技術相結合，設計高靈敏度的觀測芯片，完成生物細胞的實時動態測量。常熟理工學院畢業設計（論文）33參考文獻參考文獻1 顧祖維. 細胞組學. 環境與職業醫學,